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子痫前期(preeclampsia,PE)是以高血压、蛋白尿及脏器受损为主要临床表现的妊娠特有性疾病,是围产期母儿死亡的主要原因之一。迄今为止,其发病机理尚未完全阐明。学术界普遍认可的发病机制包括:子宫螺旋动脉重塑障碍、胎盘浅着床、胎盘氧化应激、血管内皮细胞损伤及炎症免疫过度激活等。目前,子痫前期最有效的治疗手段仍为终止妊娠,深入研究子痫前期的发病机制并寻求其有效的治疗靶点对于改善妊娠结局十分重要。早期研究发现可溶性fms样酪氨酸激酶-1(soluble fms-like tyrosine kinase 1,s Flt-1)在子痫前期患者外周血及胎盘滋养细胞中显著高表达,s Flt-1通过与血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及胎盘生长因子(Placental growth factor,PLGF)相结合,阻断VEGF及PLGF的促血管生成及血管活性物质释放等生物学活性,导致血管生成障碍及血管内皮损伤,进而诱发子痫前期。但是,调控s Flt-1表达的分子机制尚未明确。研究指出s Flt-1的表达水平受微小RNA(micro RNA,mi RNA)调控。mi RNA是一类含有21-25个核苷酸的非编码小RNA。mi RNA在早期胎胚发育、细胞分化、细胞凋亡、细胞增殖以及肿瘤的发生过程中起着重要的调节作用。多个mi RNA可在子痫前期患者体内特异性及差异性表达,先前研究证实这些mi RNA在细胞粘附、信号转导、免疫调节、血管生成等过程中发挥重要作用,参与子痫前期的发生与发展。mi R-139-5p位于人染色体11q13.4区域,全长23nt,是目前比较公认的抑癌基因,研究发现mi R-139-5p在子痫前期患者胎盘组织中的表达显著下调,但其在子痫前期中的作用机制仍有待进一步研究。有报道指出mi R-139-5p可以靶向抑制Flt-1在神经胶质瘤细胞中的表达,而s Flt-1是由Flt-1基因编码的m RNA前体剪切而成,生物信息学软件Target Scan(www.targetscan.org)预测mi R-139-5p与s Flt-1 3’-UTR区具有互补配对序列,我们推测mi R-139-5p可调控s Flt-1的表达并在子痫前期中发挥作用。本研究以重度子痫前期(severe Preeclampsia,s PE)的相关组织及细胞为样本,并建立子痫前期小鼠模型,探讨mi R-139-5p及s Flt-1在重度子痫前期中的表达水平及其作用机制,为研究子痫前期的发病机制和治疗子痫前期提供理论依据。第一部分mi R-139-5p及s Flt-1在重度子痫前期中的表达目的:检测s PE胎盘组织中mi R-139-5p与s Flt-1的表达水平,并研究二者的相关性。方法:1.采集s PE患者(46例)及对照组孕妇(57例)的外周血及分娩后的胎盘组织,并对胎盘滋养细胞进行培养。2.应用ELISA法检测研究对象血清中s Flt-1的表达水平,应用q RT-PCR法检测研究对象胎盘组织中s Flt-1 m RNA和mi R-139-5p的表达水平。3.用mi R-139-5p mimics及其阴性对照质粒对s PE胎盘滋养细胞进行转染,通过q RT-PCR和Western Blot研究mi R-139-5p过表达对s Flt-1表达水平的影响。4.将包含mi R-139-5p野生型结合位点和突变的结合位点的s Flt-1序列克隆到荧光素酶报告基因载体中,将二者与mi R-139-5p mimics共转染到HEK-293T细胞中,通过双荧光素酶报告基因检测mi R-139-5p与s Flt-1的靶向关系。结果:1.s PE患者血清及胎盘组织中s Flt-1的表达水平显著升高ELISA和q RT-PCR结果显示,与正常妊娠相比,s PE患者血清中s Flt-1的表达水平及胎盘组织中s Flt-1 m RNA的表达水平显著升高。2.mi R-139-5p在s PE患者胎盘组织中的表达显著下调q RT-PCR结果显示,与正常妊娠相比,mi R-139-5p在s PE患者胎盘组织中的表达显著下调。3.Spearman’s分析显示s Flt-1与mi R-139-5p在s PE患者胎盘组织中的表达水平呈负相关。4.mi R-139-5p与s Flt-1靶向关系的研究 用mi R-139-5p mimics及其阴性对照质粒对s PE患者的胎盘滋养细胞进行转染。q RT-PCR结果显示,过表达mi R-139-5p显著抑制s Flt-1m RNA在s PE滋养细胞中的高表达水平。Western Blot结果显示过表达mi R-139-5p显著降低了s Flt-1的蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因检测结果显示,当WT-s Flt-1与mi R-139-5p模拟物共转染时荧光素酶活性显着降低,而MUT-s Flt-1与mi R-139-5p模拟物共转染时荧光素酶活性无明显变化。小结:1.mi R-139-5p在s PE胎盘组织中表达下调。2.mi R-139-5p靶向调控s Flt-1参与PE发生、发展。第二部分mi R-139-5p靶向调控s Flt-1对重度子痫前期滋养细胞生物学功能的影响目的:研究mi R-139-5p及s Flt-1对s PE滋养细胞生物功能的影响。方法:1.应用mi R-139-5p mimics及其阴性对照质粒对s PE患者的胎盘滋养细胞进行转染。2.应用CCK-8法检测滋养细胞的增殖情况,同时应用q RT-PCR法对反映细胞增殖状态的核抗原(PCNA和Ki67)进行检测。3.应用Transwell法分析滋养细胞的侵袭功能,同时应用q RT-PCR对反映滋养细胞侵袭功能的基质金属蛋白酶(MMP-2,MMP-9)及其抑制剂(TIMP-1)进行检测。4.在s PE滋养细胞中过表达s Flt-1和mi R-139-5p mimics,应用CCK-8法检测滋养细胞的增殖情况,应用Transwell法分析滋养细胞的侵袭功能。结果:1.mi R-139-5p促进s PE滋养细胞的增殖CCK-8检测结果显示,与正常妊娠相比,s PE滋养细胞的增殖功能明显下降,而mi R-139-5p过表达可部分逆转这种结果。q RT-PCR结果显示s PE胎盘滋养细胞中PCNA和Ki67的m RNA的表达水平显著降低,而将mi R-139-5p mimics转染s PE滋养细胞后,PCNA和Ki67的m RNA表达水平显著升高。结果表明,mi R-139-5p促进s PE滋养细胞的增殖。2.mi R-139-5p促进s PE滋养细胞的侵袭Transwell分析显示,与正常妊娠相比,s PE滋养细胞的侵袭功能明显下降,而过表达mi R-139-5p后s PE滋养细胞的侵袭能力较前显著增强。q RT-PCR结果显示,s PE滋养细胞MMP-2,MMP-9和TIMP-1的表达水平较正常妊娠组明显下降,mi R-139-5p过表达后,s PE滋养细胞MMP-2,MMP-9,TIMP-1的表达水平显著升高。结果表明,mi R-139-5p促进s PE滋养细胞的侵袭。3.过表达s Flt-1对mi R-139-5p调控s PE滋养细胞功能的影响CCK-8分析显示,与s Flt-1共转染可抑制mi R-139-5p对滋养细胞增殖的促进作用。Transwell分析显示,过表达mi R-139-5p可使s PE滋养细胞的侵袭细胞数目增加,而与s Flt-1共转染后,滋养细胞的侵袭细胞数目减少。过表达s Flt-1可抑制mi R-139-5p对s PE滋养细胞增殖与侵袭的促进作用。小结:mi R-139-5p靶向调控s Flt-1促进s PE滋养细胞的增殖与侵袭。第三部分mi R-139-5p及芒果苷在子痫前期中相关作用机制的研究目的:建立PE小鼠模型,探讨mi R-139-5p与s Flt-1及PI3K/Akt/m TOR通路的关系。研究芒果苷对mi R-139-5p表达水平的影响及其在PE中的作用机制。方法:1.应用磷脂酰丝氨酸/磷脂酰胆碱(Phosphatidylserine/dioleoyl-phosphatidycholin,PC/PS)制备PE小鼠模型,以正常妊娠小鼠为对照,收集研究对象外周血及胎盘组织。2.应用ELISA法检测对照组、PE模型组及PE模型mi R-139-5p mimics转染组小鼠血清s Flt-1的表达水平;应用q RT-RCR方法检测三组小鼠胎盘组织中s Flt-1m RNA的表达水平。应用Western Blot方法检测三组小鼠胎盘组织中p-PI3K、p-Akt及p-m TOR的蛋白水平。3.应用mi RNA芯片分析检测PE模型组及PE+芒果苷40 mg/kg小鼠胎盘中的mi RNA表达谱。应用q RT-PCR方法检测正常妊娠组、PE模型组及PE+芒果苷40 mg/kg组小鼠胎盘组织中mi R-139-5p的表达水平。4.应用ELISA法检测对照组、PE模型组、PE+不同剂量芒果苷小鼠血清中s Flt-1的表达水平,应用q RT-RCR检测各组小鼠胎盘组织中s Flt-1m RNA的表达水平。应用Western blot法检测各组小鼠胎盘组织中p-PI3K、p-Akt及p-m TOR的蛋白水平。5.研究芒果苷对PE模型小鼠收缩压、蛋白尿及胎仔体重的影响。结果:1.过表达mi R-139-5p抑制PE模型小鼠血清及胎盘组织中s Flt-1的表达水平ELISA及q RT-RCR结果显示,过表达mi R-139-5p可降低PE模型小鼠血清及胎盘组织中高表达的s Flt-1水平。2.过表达mi R-139-5p激活PE模型小鼠胎盘PI3K/Akt/m TOR通路Western Blot结果显示,与对照组相比,PE模型小鼠胎盘p-PI3K、p-Akt、p-m TOR的蛋白表达水平显著降低,过表达mi R-139-5p可以使PE模型小鼠胎盘p-PI3K、p-Akt、p-m TOR的蛋白表达水平明显升高。3.芒果苷上调PE模型小鼠胎盘组织中mi R-139-5p的表达水平mi RNA芯片分析及q RT-PCR结果显示,芒果苷可显著上调PE模型小鼠胎盘组织中mi R-139-5p的表达水平。4.芒果苷降低PE模型小鼠血清和胎盘组织中s Flt-1的表达水平ELISA结果显示,芒果苷可以降低PE模型小鼠血清中高表达的s Flt-1水平,且随着给药剂量增加,s Flt-1的表达水平下降越明显。q RT-RCR结果显示,经芒果苷干预后,PE模型小鼠胎盘组织中高表达的s Flt-1 m RNA的水平呈下降状态,且芒果苷给药剂量越大,s Flt-1 m RNA的下降水平越明显。5.芒果苷可激活PE模型小鼠胎盘PI3K/Akt/m TOR通路Western blot结果显示,与对照组相比,PE模型小鼠胎盘p-PI3K、p-Akt和p-m TOR的蛋白水平显著降低。经芒果苷干预后,PE模型组小鼠胎盘p-PI3K,p-Akt和p-m TOR的蛋白水平较前升高,且芒果苷给药剂量越大,其升高越明显。6.芒果苷改善PE小鼠模型的妊娠结局芒果苷可降低PE模型组小鼠的收缩压及蛋白尿水平并增加胎仔体重。且芒果苷干预剂量越大,小鼠收缩压及蛋白尿下降越明显,胎仔体重增加越明显。小结:1.应用PC/PS可成功建立PE小鼠模型。2.mi R-139-5p激活PI3K/Akt/m TOR通路在PE模型小鼠中发挥作用。3.芒果苷可通过上调mi R-139-5p改善PE模型小鼠妊娠结局。结论:1.mi R-139-5p在s PE胎盘组织中表达下调。2.mi R-139-5p靶向调控s Flt-1促进s PE滋养细胞的增殖与侵袭。3.mi R-139-5p激活PI3K/Akt/m TOR通路在PE模型小鼠中发挥作用。4.芒果苷可通过上调mi R-139-5p改善PE模型小鼠妊娠结局。