Elp3依赖HAT活性参与肝癌发生发展的机制研究

来源 :苏州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:gir1s
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
目的:构建Elp3序列敲除重组表达质粒,通过与过表达Elp3及干扰Elp3质粒组对比,研究Elp3蛋白在肝癌发生发展中的作用与其HAT结构域和参与Elongator复合体构建的关系。方法:1.测序及双酶切鉴定PIRES2-EGFP-Elp3及四个序列敲除重组表达质粒。2.RT-PCR、western blot鉴定293a细胞及HepG2细胞瞬时转染各组质粒后,目的基因mRNA,蛋白表达。3.通过Real-time PCR、western blot检测HepG2细胞瞬时转染各组质粒后,Elp3 mRNA,蛋白表达水平。4.CCK-8检测各组细胞增殖能力的变化情况。5.划痕实验检测各组细胞迁移能力的变化情况。6.Transwell实验检测各组细胞迁移、侵袭能力的变化情况。7.以OTM为指标,彗星电泳检测辐照后各组细胞DNA损伤修复情况。8.Western blot检测各组细胞Elp3、Elp4、AKT、p-AKT、MMP2、MMP9等指标的变化情况。结果:1.测序及双酶切鉴定表明,插入表达重组载体中的目的基因序列准确,长度无误:elp3-d1(1374bp),elp3-d2(1110bp),elp3-d3(1239bp),elp3-d4(636bp),elp3(1692bp)。2.RT-PCR检测结果表明,重组表达载体中的目的基因能够表达出正确的mRNA;western blot检测结果表明,重组表达载体中的目的基因在293a细胞及HepG2细胞中均能正确表达目的蛋白:Elp3-d1(50kDa),Elp3-d2(40k Da),Elp3-d3(45kDa),Elp3-d4(27kDa),Elp3(62kDa)。3.Real-time PCR检测及Western blot检测结果表明,表达载体中序列基因表达1出的目的蛋白并没有影响细胞中内源性elp3mrna、蛋白表达,elp3-d1、elp3-d2、elp3-d3、elp3-d4组表达量与hepg2组比,差异没有统计学意义;elp3过表达组细胞内elp3蛋白表达增高,elp3干扰组(elp3i)细胞内elp3蛋白表达减少。4.cck-8检测结果显示,相比于hepg2组,elp3干扰组及过表达elp3-d1蛋白的细胞增殖能力显著下调;过表达elp3、elp3-d3蛋白的细胞增值能力显著增强;过表达elp3-d2、elp3-d4蛋白的细胞无显著差异。5.划痕实验检测结果显示,相比于hepg2细胞,elp3干扰组及过表达elp3-d1蛋白的细胞迁移能力下降;过表达elp3、elp3-d3蛋白的细胞迁移能力明显增强;过表达elp3-d2、elp3-d4蛋白的细胞无显著差异。6.transwell实验检测结果显示,相比于hepg2细胞组,elp3干扰组及过表达elp3-d1蛋白细胞,迁移能力减弱,穿膜侵袭能力下调;过表达elp3、elp3-d3蛋白的细胞迁移能力增强,穿膜侵袭能力增强;过表达elp3-d2、elp3-d4蛋白的细胞无显著差异。7.彗星电泳检测结果发现,8gy/min剂量辐照后,相比于hepg2细胞,elp3干扰组及过表达elp3-d1蛋白的细胞,在损伤后修复速度及修复能力上下降明显;过表达elp3、elp3-d3蛋白的细胞修复速度提高,修复能力增强;过表达elp3-d2、elp3-d4蛋白的细胞无显著差异。8.westernblot检测各组细胞,elp3、elp4、akt、p-akt、mmp2、mmp9表达水平。结果发现,相比于hepg2细胞组,elp3干扰组及过表达elp3-d1蛋白的细胞组,akt激活水平及下游mmp2、mmp9蛋白表达水平略有下调;过表达elp3、elp3-d3蛋白的细胞组,akt激活水平及下游mmp2、mmp9蛋白表达量提高;过表达elp3-d2、elp3-d4蛋白的细胞组内相关蛋白无显著差异。结论:1.成功构建elp3过表达质粒及序列敲除重组表达质粒,正确表达出目的蛋白。2.重组表达质粒表达出的目的蛋白不影响elp3内源性表达。3.elp3蛋白在肝癌细胞中促进增殖,促进迁移侵袭,促进dna损伤修复等作用依赖其hat活性。4.elp3激活akt信号通路依赖elongator复合体结构完整性及hat功能完整性。5.Elp3参与细胞多种活动,可能是通过乙酰化引起基因激活而非直接作用于信号通路完成的。
其他文献
血缘社会是中国古代法的一面镜子,如果我们想要深入了解古代法律制度,就必须对血缘社会有所研究。由于小农经济在华夏大地的主导地位和商业发展的不完善,具有严格等级观念的
时代的发展,科学技术和医疗水平的提高,老年人口数量增多,人口平均寿命延长,老年人口的增加对于家用医疗器械的需求也不断增加。随着智能时代的到来,家用医疗器械的功能不断增加,产品功能的增加也就意味着使用方式的改变,老年人在使用过程中也会存在很多问题。在人口老龄化的社会背景下,通过研究老年人心理层面、生理层面特征对家用医疗器械的影响,透析老年人对家用医疗器械的设计需求和情感体验,对现有家用医疗器械所存在
【目的】研究以体外构建的重组质粒pcDNA3.1~+-CD44(s1-s5)负载的树突状细胞(DC)与同源细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养后,对微球体培养法富集的乳腺癌干细胞(BCSC)的杀伤
船舶重要组成部分之一就是电气设备,电气设备的工作环境具有特殊性,对安装设置和管理维护有较高的要求。在船舶电气设备的使用管理上,要结合其特殊的用电条件和环境,对电气设
目的:探讨后路寰枢椎椎弓根钉板系统内固定治疗可复性齿状突陈旧性骨折的效果。方法:选取2009年1月至2014年2月广西医科大学第一附属医院脊柱外科收治的22例可复性齿状突陈旧
目的:探究HER-2与VEGF-C在胃癌组织中的表达及其与胃癌不同临床病理特征之间的相关性。方法:严格按照入选标准选择61例行胃癌D2根治术患者手术标本。运用免疫组化技术分别检
基于C/S体系结构开发的教学管理系统。可以实现数据的统一管理。保证数据的安全性和完整性。还可实现数据的共享,方便各个用户在不同的工作场所对数据进行处理。
目的:探讨蒙脱石散联合合生元益生菌治疗小儿非感染性腹泻的临床疗效。方法:回顾性分析2015年2月至2017年5月本院86例非感染性腹泻患儿的临床资料,采用随机数字表法将入选的
采用气相色谱法测定环氧丙烷中乙醛、丙醛的质量分数,测定结果的相对标准偏差均小于10%,方法的回收率范围为(100±5)%,检测限低至1×10-6,证明该方法能快速、简便、准
介绍了与涂硼正比计数管性能参数相关的因素,从涂硼管自身的结构设计、制作工艺、管外慢化体设计的角度,对提高其性能的技术方法进行了综述分析,推导了硼含量和涂硼层厚度与