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【目的】研究以体外构建的重组质粒pcDNA3.1~+-CD44(s1-s5)负载的树突状细胞(DC)与同源细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养后,对微球体培养法富集的乳腺癌干细胞(BCSC)的杀伤效果,为后期动物体内实验的开展及过继免疫疗法的临床推广奠定基础。【内容】本课题主要由三部分组成:第一部分通过半定量RT-PCR法检测6株乳腺癌细胞(MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231、T-47D、ZR-75-1、BT-549)中CD44的表达丰度,据此选取克隆目的基因片段的细胞来源,通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1~+-CD44(s1-s5),以酶切和基因测序的方式对重组质粒进行鉴定;第二部分以载体质粒p EGFP-C3与重组质粒pcDNA3.1~+-CD44(s1-s5)分别转染293T细胞,前者于荧光显微镜下观察转染效率,后者利用Western blot检测质粒表达情况,并以通过亚克隆法构建的原核表达质粒p ET32a-CD44(s1-s5),经过转接、IPTG诱导过夜后高温变性破除菌壁释放出的蛋白再次进行Western blot,以验证蛋白分子量的改变是否与糖基化等蛋白翻译后修饰有关;第三部分以构建成功的重组质粒pcDNA3.1~+-CD44(s1-s5)转染以正常人外周血分离出的单个核细胞诱导生成的DC后与同源CIK细胞共同培养成熟,体外杀伤利用微球体培养法富集的BCSC,通过LDH释放法检测杀伤活性。【方法】1、常规培养乳腺癌细胞株MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231、T-47D、ZR-75-1、BT-549,应用半定量RT-PCR法检测各细胞中CD44的表达丰度。2、依据方法1检测结果选取适当细胞系提取RNA,以反转录生成的c DNA为模板进行PCR,与载体pcDNA3.1~+分别双酶切后连接转化感受态JM109。小量扩增提取质粒,通过酶切、基因测序方法鉴定重组质粒是否构建成功。3、结果正确的菌落转接后进行质粒的大量提取,与载体质粒p EGFP-C3分别转染293T细胞,检测转染效率及蛋白表达情况。4、从pcDNA3.1~+-CD44(s1-s5)上双酶切获得目的基因片段,应用亚克隆法构建原核表达质粒p ET32a-CD44(s1-s5),快速转化感受态BL21,扩增。5、按菌液和培养基1:100的体积比进行转接,待OD600达到0.6,留取部分菌液作为诱导前蛋白表达对照后即加入相应量IPTG诱导4h,收菌加入Loading Buffer高温变性30min后利用Western blot检测蛋白表达情况。6、以添加EGF、b FGF及B27的无血清培养基,按5×103/m L密度接种MDA-MB-231细胞进行培养,2~3d换1次液,观察细胞成球过程,记录微球培养前后细胞形态变化。7、利用密度梯度离心法从正常人外周血中分离出单个核细胞,加入相应细胞因子分别诱导生成DC和CIK,以pcDNA3.1~+-CD44(s1-s5)对DC进行化学转染后与CIK细胞共同培养,待成熟后杀伤上述微球体培养法富集的BCSC。8、通过Cyto Tox96非放射性细胞毒性检测法检测各效靶比的实验组和对照组492nm波长处LDH释放值,计算细胞毒性百分比来判别杀伤效果。【结果】1、6株乳腺癌细胞中MDA-MB-231的CD44表达丰度最高,可以作为基因克隆、微球体培养的细胞来源。2、经酶切、基因测序证实重组质粒pcDNA3.1~+-CD44(s1-s5)构建成功,转染293T细胞后,经Western blot检测蛋白大小与预测值略有差异。3、转化进原核表达质粒的菌液经IPTG诱导后CD44蛋白表达良好,而条带大小与真核表达蛋白及预测值均有差异。4、无血清悬浮培养MDA-MB-231细胞7d成球,10d后细胞球致密且状态最佳,适合留取备用。5、正常人外周血中分离出的单个核细胞分别经相应细胞因子诱导培养7d后,DC形态趋于成熟,CIK细胞数目较前明显增多。6、通过LDH释放法检测各效靶比的实验组杀伤活性均高于对照组(P<0.05)。【结论】1、利用基因重组技术可以成功构建质粒pcDNA3.1~+-CD44(s1-s5)和p ET32a-CD44(s1-s5)。2、CD44真核蛋白表达的分子量与预测值略有差异,提示CD44蛋白可能存在糖基化等翻译后修饰过程。3、负载CD44抗原的DC-CIK杀伤BCSC效果优于载体质粒负载的DC-CIK,提示CD44在其中发挥了关键作用,这为过继免疫疗法在肿瘤治疗中的应用奠定了良好的实验基础。