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背景:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是人类最常见的消化系统恶性肿瘤之一。近年来,CRC的发生率和死亡率呈明显上升趋势。恶性肿瘤的侵袭生长和远处转移都需要充足的营养和能量代谢,因此肿瘤细胞需要调节自身能量代谢状态以满足自身快速生长和侵袭转移的需要,即代谢重编程,其中“有氧糖酵解”是肿瘤糖代谢的主要方式,抑制糖酵解可以明显抑制肿瘤增殖和侵袭转移。6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2(6-Phosphofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase,PFKFB)催化合成反应Fru-6-P+ATP→Fru-2,6-BP+ADP和水解反应Fru-2,6-BP+H2O→Fru-6-P+P。2,6-双磷酸果糖是6-磷酸果糖激酶-1(6-phosphofructo-1-kinase,PFK-1)的变构激活剂和糖酵解最有效的刺激剂[1]。PFKFB广泛存在于各种生物细胞中,PFKFB家族通过调节2,6-双磷酸果糖(2,6-diphosphate fructose,F-2,6-BP)表达进而调控细胞内的糖酵解水平[2]。PFKFB家族目前已知的同工酶有PFKFB1、PFKFB2、PFKFB3、PFKFB4四种。这些同工酶由四个不同的基因PFKFB1-4编码,分别位于不同的染色体上[3]。这些酶的表达水平和活性由激素和代谢物调控[4,5]。所有同工酶均含有激酶和磷酸酶活性的高度保守的核心结构。现有研究表明缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor,HIF-1α)能够诱导PFKFB在肿瘤中的表达,且PFKFB能够发挥促癌因子的作用[6],但其在CRC中的表达及其与患者预后的关系尚不十分清楚。因此,本研究检测了PFKFB在CRC和癌旁组织中的表达情况,评估PFKFB与HIF-1α之间的表达相关性,探讨其与患者临床病理特征、预后等的关系,选出对CRC患者预后相关性最大的基因作为目的基因,并观察目的基因敲低后在体外对CRC细胞糖代谢、增殖与侵袭转移能力的影响,为临床上CRC患者的预后指标和糖代谢靶向治疗提供新的对策和思路。目的检测6-磷酸果糖-2-激酶(PFKFB)在CRC及癌旁组织中的表达,并探讨其临床意义和体外对CRC细胞糖代谢、增殖、侵袭转移能力的影响。方法应用第三军医大学西南医院90例CRC组织标本和相应90例癌旁组织及正常人结肠上皮细胞株(FHC、CCD841)和人CRC细胞株(Lovo、HT-29、HCT-116、RKO、SW620、SW480)作为研究对象。分三部分进行:第一部分探讨CRC组织中PFKFB1、PFKFB2、PFKFB3、PFKFB4、HIF-1α蛋白表达与各项临床病理参数的关系,以及PFKFB与HIF-1α之间的表达相关性:(1)应用组织芯片结合免疫组化技术检测第三军医大学西南医院90例CRC组织标本和相应90例癌旁组织中PFKFB1、PFKFB2、PFKFB3、PFKFB4及HIF1-α的表达情况;(2)统计CRC中PFKFB3的表达与患者临床预后的关系;(3)检测PFKFB3的表达与HIF-1α表达之间的相关性。所有统计分析使用SPSS 19.0统计软件,若P<0.05,则认为结果有显著统计学差异。第二部分建立PFKFB3低表达稳定细胞株,检测敲低PFKFB3前后肿瘤细胞糖代谢的变化。(1)检测正常人结肠上皮细胞株(FHC、CCD841)和人CRC细胞株(Lovo、HT-29、HCT-116、RKO、SW620、SW480)中PFKFB3表达情况:采用定量PCR技术检测上述细胞株中PFKFB3的mRNA表达水平;采用Western blot技术检测PFKFB3蛋白的表达情况。(2)利用慢病毒感染CRC细胞株,敲低细胞株中PFKFB3的表达。感染空白对照慢病毒的细胞为对照组,感染敲低PFKFB3基因的慢病毒细胞为PFKFB3低表达组,并通过药物筛选、定量PCR技术检测和Western blot技术筛选鉴定出PFKFB3低表达的稳定细胞株。(3)应用检测肿瘤细胞上清液内乳酸、葡萄糖含量的方法,探讨对照组和PFKFB3低表达组CRC细胞内糖酵解活性状况。第三部分检测PFKFB3对体外培养的CRC细胞增殖与侵袭转移能力的影响:(1)应用CCK8细胞增殖活性实验、克隆形成实验检测对照组和PFKFB3低表达组CRC细胞的增殖活性状况;(2)应用Transwell实验、细胞侵袭实验检测对照组和PFKFB3低表达组CRC细胞的侵袭转移能力。结果第一部分(1)PFKFB1、PFKFB2、PFKFB3、PFKFB4和HIF-1α在90例CRC组织中高表达例数分别为57、59、59、51和60,表达均显著高于相应癌旁组织(P<0.05)。(2)PFKFB3在CRC组织中的高表达与肿瘤的大小、临床分期、淋巴结转移及预后等密切相关(P<0.05)。高表达组比低表达组预后差(P=0.008),临床分期高的CRC患者中,PFKFB3的高表达提示了临床预后差(P=0.009),但在临床分期低的患者中不存在这种差异(P=0.490)。(3)PFKFB3的表达同HIF-1α的表达具有相关性(r=0.627,P<0.001)。(4)PFKFB1、PFKFB2和PFKFB4的表达与CRC的肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移及预后等无显著相关性(P>0.05)。根据结果,选用PFKFB3作为下一步实验的目的基因。第二部分(1)不同人结肠细胞株中PFKFB3蛋白表达情况存在差异。采用定量PCR技术检测,与正常结肠上皮细胞株(FHC、CCD841)相比较,侵袭力较低的结肠癌细胞株RKO、Lovo中PFKFB3 mRNA低表达,而侵袭力较高的结肠癌细胞株HT-29、HCT-116、SW620、SW480中PFKFB3 m RNA高表达。采用Western Blot技术检测,与正常人结肠上皮细胞株(FHC、CCD841)相比较,结肠癌细胞株RKO、Lovo中PFKFB3蛋白为低表达,HT-29、HCT-116、SW620、SW480中PFKFB3蛋白为高表达,同定量PCR检测结果一致。(2)选用SW480、SW620两种CRC细胞株,分别感染敲低PFKFB3基因的慢病毒,经药物筛选、定量PCR技术和Western blot技术检测,鉴定出PFKFB3低表达稳定细胞株。(3)SW480、SW620细胞敲低PFKFB3后细胞糖酵解能力发生改变:与对照组相比,PFKFB3低表达组细胞上清液内葡萄糖、乳酸含量均明显下降,二者差异具有统计学意义(P<0.05)。第三部分(1)经CCK8细胞增殖活性实验、克隆形成实验检测,SW480、SW620细胞敲低PFKFB3后细胞增殖情况发生改变:与对照组相比,PFKFB3低表达组细胞增殖能力明显下降,二者差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)经Transwell实验、细胞侵袭实验检测,SW480、SW620细胞敲低PFKFB3后细胞侵袭转移能力发生改变:与对照组相比,PFKFB3低表达组细胞侵袭转移能力明显下降,二者差异具有统计学意义(P<0.05)。