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目的:非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）,是世界上最重要的肝病之一,然而医学界目前尚无经批准的特异性治疗药物。当NAFLD进展至脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis,NASH）伴或不伴肝纤维化阶段,而未采取确切的治疗措施时,容易进展至该病的晚期,甚至发展为肝癌。即使是单纯性脂肪肝,目前也已经证实与心脑血管疾病有关,严重影响人们生活质量,多年来NAFLD的防治一直是医学界关注的热点。目前,尚无理想的针对NAFLD的防治药物。鉴于NAFLD与2型糖尿病具有相似的脂质代谢紊乱特点,且在临床诊治过程中,我们发现钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂（sodium-glucose co-transporter inhibitor 2 inhibitors,SGLT2i）具有改善2型糖尿病患者脂代谢紊乱的作用,因此本研究探讨SGLT2i是否能改善NAFLD患者的脂代谢。但现有文献大多基于动物模型或合并2型糖尿病的NAFLD患者,根据目前报道的实验室及临床结果,SGLT2i改善NAFLD的具体机制有待更深入挖掘。达格列净（Dapagliflozin）是目前临床已广泛用于治疗糖尿病的SGLT2i之一,已有文献报道达格列净对合并2型糖尿病的NAFLD患者有改善作用,但其中的具体机制有待进一步明确。本研究模拟人类进食习惯,首先通过高脂饲料喂养建立SD大鼠NAFLD模型,通过选取正常大鼠及NAFLD大鼠肝组织行转录组学分析,筛选差异表达基因,推测导致NAFLD的基因调控机制。此后,应用达格列净在体内干预NAFLD大鼠,体外干预脂毒性肝细胞,阐明达格列净改善NAFLD的作用机制。研究方法:第一部分:体内构建大鼠NAFLD模型,基于转录组学探讨高脂饮食诱导NAFLD的相关机制。4-5周龄雄性SD大鼠随机分为正常饲料喂养组（NC组）及高脂饲料喂养组（HFD组）。HFD组给予高脂饲料喂养方式建立NAFLD大鼠模型,通过苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）、油红O染色方法及NAS评分从形态学角度明确肝脏病变情况。取NC组及HFD组大鼠肝组织进行转录组学分析,筛选差异表达基因,推测导致NAFLD的相关基因,并应用Real-time PCR的方法进行验证。第二部分:运用肝脏转录组学、血清代谢组学、粪便16s r DNA测序、免疫荧光、Western blot及Real-time PCR的方法探讨达格列净对NAFLD大鼠的治疗机制。采用免疫组化方法验证SGLT2在大鼠肝脏组织的表达。SD大鼠分为普通饲料喂养组（NC组）,普通饲料喂养达格列净灌胃组（ND组）,高脂饲料喂养组（HFD组）,高脂饲料喂养达格列净灌胃组（HD组）。1mg/Kg/d达格列净连续干预5周。通过肝脏转录组及血清代谢组联合分析,明确达格列净是否通过第一部分转录组筛选的关键基因改善NAFLD,通过粪便16s r DNA测序并与血清代谢产物联合分析,明确达格列净对高脂喂养大鼠的肠道菌群结构和功能的影响,探讨其可能的调控机制。检测达格列净对各组SD大鼠生理指标的影响。使用ELISA试剂盒,检测各组大鼠肝脏组织及血清TNF-α、IL-1β及IL-10的分泌水平。采用免疫荧光、Western blot及Real-time PCR方法对通路上的关键因子进行测定,明确达格列净改善NAFLD的相关机制。第三部分:体外应用达格列净干预脂毒性肝细胞,结合转录组学结果进一步明确达格列净改善NAFLD的分子机制。应用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基体外培养L02细胞,运用500μM油酸作用于L02细胞使其诱导产生脂毒性。应用Cell Counting Kit-8（CCK8）、TG含量、油红O染色检测不同浓度的达格列净（10μM,40μM,80μM、120μM）对OA作用下L02细胞的存活率及细胞脂毒性的影响。选择适宜的达格列净浓度。将细胞分为BSA组（无血清的BSA培养基）,OA组（500μM油酸培养基）,DAPA组（40μM达格列净培养基）。采用Real-time PCR、Western blot、si RNA沉默基因的方法,从细胞层面进一步明确达格列净改善NAFLD的分子机制。结果:第一部分:NAFLD大鼠模型的建立,定位差异表达基因及通路1.高脂饲料连续喂养12周成功建立NAFLD大鼠模型,肝脏组织HE及油红O染色、NAS评分证明造模成功。2.大鼠肝脏转录组学结果显示,NC组及HFD组差异表达基因中,富集于KEGG通路且差异表达倍数中改变最明显的是硬脂酰辅酶A去饱和酶（stearoylCo A desaturase,Scd1）,该结果通过Real-time PCR得到证实。根据KEGG通路图,确定Scd1主要富集于:PPAR信号通路、不饱和脂肪酸的生物合成通路,以及AMPK信号通路。第二部分:肝脏转录组学、血清代谢组学、粪便16s r DNA测序、免疫荧光、Western blot及Real-time PCR在达格列净干预NAFLD大鼠后的相关结果1.免疫组化结果显示,SGLT2在大鼠肝脏组织上存在表达。2.转录组学结果显示:达格列净可以抑制Scd1的表达,该作用是通过激活PPARα通路同时调节Cpt1a实现的。非靶向代谢组学结果:达格列净干预NAFLD大鼠,差异代谢物主要富集于甘油磷脂代谢通路。Pearson关联的结果提示,Ppara、Cpt1a及Scd1与差异代谢产物具有密切相关性。16s r DNA测序及与血清代谢产物联合分析显示,达格列净通过改善肠道菌群的结构和功能,改善了NAFLD模型大鼠的代谢表型。3.达格列净干预NAFLD大鼠,对体重、TG、TC、ALT、AST,糖耐量等相关生理指标均有明显改善,但对正常组大鼠血糖无明显影响,且影响了炎症因子分泌。免疫荧光共聚焦的结果显示,达格列净可以抑制SCD1的表达,并且同时上调CPT1A的表达。Real-time PCR及WB结果显示,HFD组大鼠肝脏组织PPARα及CPT1A基因及蛋白的表达均低于NC组,SCD1基因及蛋白的表达均高于NC组（P＜0.01）;HD组大鼠肝脏组织PPARα及CPT1A基因及蛋白的表达均高于HFD组,SCD1基因及蛋白的表达均低于HFD组（P＜0.01）。WB结果显示,与NC组大鼠比较,HFD组大鼠肝脏组织中RXR和PPARα的下游FGF21,CES1和ACADSB蛋白表达量明显降低;与HFD组大鼠比较,HD组大鼠肝脏组织中FGF21,CES1和ASADSB蛋白表达量明显增加。另外与转录组数据结果一致,SREBP1的表达量也在HD组明显上升对比HFD组。达格列净同时也降低了肝脏中脂肪酸合成蛋白FASN,ACC和p-ACC的表达量并且促进的支链氨基酸的分解代谢限速酶BCAT和BCKDH的表达对比于HFD组。第三部分:体外应用达格列净干预脂毒性肝细胞,通过抑制PPARα信号通路探讨达格列净调节脂代谢的机制1.用500μM油酸组（OA组）作用于L02细胞24小时,诱导L02细胞产生脂毒性。将500μM油酸与不同浓度达格列净共同孵育细胞24小时,CCK8结果显示,当达格列净浓度超过80μM时,细胞存活率下降（P＜0.05）。油红O染色及TG测定结果提示,达格列净可改善L02细胞的脂毒性,40μM达格列净作用效果最佳。2.Real-time PCR及WB结果显示,OA组L02细胞PPARα及CPT1A基因及蛋白的表达均低于BSA组,SCD1基因及蛋白的表达均高于BSA组（P＜0.01）;DAPA组L02细胞PPARα及CPT1A基因及蛋白的表达均高于OA组,SCD1基因及蛋白的表达均低于OA组（P＜0.01）。3.si RNA沉默Ppara基因,PPARα通路抑制情况下SCD1基因及蛋白表达量均明显升高,肝细胞内TG水平升高（P＜0.01）;达格列净干预可增强PPARα及CPT1A基因及蛋白表达,抑制SCD1基因及蛋白表达,改善肝细胞内TG水平。结论:达格列净激活PPARα通路,同时正反向调节CPT1A及SCD1 m RNA及蛋白的表达,激活了甘油磷脂代谢通路,调节了肝脏组织中脂肪酸和氨基酸的代谢与合成,并通过改善肠道菌群的结构和功能调节脂质代谢并增加能量代谢,改善NAFLD。