精原干细胞具有自我复制和分化成精子的能力,是动物体内唯一能进行遗传信息传递的干细胞。因此,精原干细胞既是干细胞生物学的重要研究对象,又是研究精子发生、制作转基因动物和研究基因功能的重要资源。Brister等人于1994年创立的精原干细胞移植技术,以及Nagano等人于2001年和Hamra等人于2002年分别用不同的载体遗传修饰精原干细胞成功地产生了转基因小鼠或大鼠等研究为揭示精子发生过程和制作转基因动物提供了新的方法。然而,精原干细胞的体外长期培养却在很长的时间里没有获得成功。可喜的是,这一障碍被最近的研究所突破,日本和美国的几个实验室先后报道了小鼠和大鼠的精原干细胞能在体外长期培养和增殖。在本研究中,我们首先建立了一种分离和富集小鼠精原干细胞的体系,富集的小鼠精原干细胞在移植到受体睾丸后启动了精子发生过程,并产生了供体细胞来源的后代小鼠,对富集的精原干细胞进行体外培养表明,来自昆明白乳鼠的精原干细胞在我们设计的无血清培养基和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上能够增殖近1个月的时间。我们应用了DBA/2、ICR、KM（昆明白）三个品系的野生型小鼠和一个细胞普遍表达绿色荧光蛋白（EGFP）基因的ICR转基因小鼠。睾丸取自出生后4至5天（出生日定为0天）的雄性乳鼠,并通过两步消化酶消化法收集睾丸细胞。消化液I是含0.2%胶原酶IV或者V和200μg/ml DNA酶的D-PBS,消化液II是含0.2%胶原酶IV或者V、0.2%透明质酸酶和200μg/ml DNA酶的无血清DMEM。去掉睾丸白膜后的睾丸组织样品经PBS洗涤3遍后,用10倍体积的消化液I在室温下作用3至5分钟。在此期间,用吸管轻轻吹打。然后加入5至10毫升PBS,170g离心3分钟,反复3次以去除睾丸间质细胞,收集曲细精管样品。后者用5倍体积的消化液II消化2至5分钟,伴随着吸管反复吹打。消化好的细胞悬液中加入5至10毫升PBS或含10%血清的DMEM,混匀后,用60μm孔径的尼龙网过滤。滤出液于200g离心5分钟,反复洗涤3次。最后用贴壁分选培养基重悬细胞,接种到0.2%明胶包被的培养瓶,置于37°C、5%CO2培养箱中培养。睾丸中的支持细胞和间质细胞等体细胞对精原干细胞的增殖有负作用。为了尽快去除体细胞,我们采用含10%血清、2 mM谷氨酰胺、100 unit/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基对睾丸细胞进行差异贴壁分选。我们发现用此培养基培养睾丸细胞时,支持细胞贴壁快,而生精细胞只是贴附在支持细胞层上,并且易于吹打悬起,可通过轻轻吹打后,将漂浮的细胞转移至新的明胶包被的培养瓶中贴壁培养。我们连续贴壁分选3次,时间分别为接种后的1、4、20小时。第3次贴壁后是否转瓶培养要根据支持细胞的去除程度和生长状况而定。为验证差异贴壁分选的效率,我们对第3次贴壁培养过夜的分选出的细胞进行了流式分析,以新分离的未分选睾丸细胞的流式分析结果作为对照。检测抗原是Thy-1、EP-CAM和GFRα1等,这些抗原已被证明是精原干细胞标志抗原。流式分析结果表明,经过连续三次贴壁分选后,精原干细胞分别被富集了20.3、11、14.8倍。与以前报道的利用这三种抗原进行的免疫激活细胞分选和荧光激活细胞分选的效率相比,我们的