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第一部分含碘造影剂致人肾小管上皮细胞损伤作用的研究目的以体外培养的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)为模型,比较高渗、低渗、等渗含碘造影剂泛影葡胺、碘海醇和碘克沙醇的细胞毒作用。并进一步探讨低渗造影剂碘海醇致细胞凋亡、氧化应激的特点和渗透压在细胞损伤中的作用。方法1.体外培养的HK-2细胞分为培养基对照组和造影剂刺激组-泛影葡胺组,碘海醇组,碘克沙醇组。用细胞增殖/毒性试剂盒(CCK-8)分别观察各组同一浓度(100mg I/ml)不同作用时间(2h,4h,6h)和同一作用时间(6h)不同浓度(25,50,100,125mg I/ml)的细胞活力。2.HK-2细胞分为培养基对照组,碘海醇刺激组。用Hoechst33342染色在荧光显微镜下观察细胞凋亡形态,流式Annexin V-FITC/PI双染和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)活性比色法观察上述时间梯度和浓度梯度下细胞凋亡变化。3.HK-2细胞分为培养基对照组,碘海醇刺激组(100mg I/ml,6h),甘露醇等渗对照组。CCK-8法观察细胞活力,流式Annexin V-FITC/PI双染和caspase-3活性比色法观察细胞凋亡,流式DCFH-DA细胞内标记法比较活性氧(ROS)变化。结果1.高渗造影剂泛影葡胺和低渗造影剂碘海醇致HK-2细胞活力呈时间依赖和碘剂量依赖性下降(P<0.01),等渗造影剂碘克沙醇于本研究范围内未见细胞毒作用。2.碘海醇刺激组与培养基对照组比,Hoechst33342染色见细胞核浓聚,凋亡小体生成;流式双染凋亡率和caspase-3活性呈时间(P<0.01)和碘剂量依赖性升高(P<0.05)。3.碘海醇(100 mg I/ml、6h)组ROS较培养基对照组升高(P<0.01)。4.甘露醇等渗对照组的细胞活力较培养基对照组无明显下降(P>0.05)、流式双染凋亡率(P<0.05)、caspase-3活性(P<0.05)和ROS升高(P<0.01),均低于碘海醇刺激组(P<0.05)。结论在HK-2细胞的细胞毒损伤中,等渗造影剂碘克沙醇作用最轻、高渗造影剂泛影葡胺细胞毒力最大、低渗造影剂碘海醇居中,且后两者呈时间及碘剂量依赖性变化。碘海醇呈时间及碘剂量依赖性导致HK-2细胞凋亡率增加。氧化应激参与了细胞损伤。渗透压不能完全解释碘海醇导致HK-2细胞的直接损伤作用。第二部分牛磺酸对碘海醇损伤HK-2细胞的保护作用研究目的本研究拟探讨牛磺酸对碘海醇致HK-2细胞损伤的保护作用及部分机制。方法将体外培养的HK-2细胞分为①培养基对照组,②牛磺酸(3,12,24mmol/L)+培养基组,③碘海醇刺激组(100mg I/ml、6h),④牛磺酸(3,12,24mmol/L)+碘海醇(100mg I/ml、6h)共作用组。1.用细胞增殖/毒性试剂盒(CCK-8)测定细胞活力;流式Annexin V-FITC/PI双染和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)活性比色法观察细胞凋亡。2.流式DCFH-DA细胞内标记法测定细胞活性氧(ROS)。3.选取牛磺酸(24mmol/L)+碘海醇(100mg I/ml、6小时)作为干预组,用Westen blot检测细胞Bcl-2、Bax的表达。结果1.牛磺酸加入培养基组对细胞活力、凋亡率、caspase-3活性、ROS及Bcl-2、Bax表达无影响(P>0.05)。2.牛磺酸呈剂量依赖性增加细胞活力,减轻凋亡。牛磺酸(3,12,24mmol/L)干预后和碘海醇刺激组比,细胞活力分别为(88.00±1.00)%,(91.33±0.58)%,(95.67±1.52)%比(76.67±1.53)%(P<0.05)。流式AnnexinV-FITC/PI双染法示细胞凋亡率分别为(8.84±1.75)%,(7.86±1.82)%,(6.30±1.50)%比(11.98±0.39)%(P<0.01)。caspase-3的活性以培养基对照组的倍数表示,分别为(1.33±0.10)倍,(1.27±0.0)倍和(1.10±0.04)倍比(1.42±0.1)倍(P<0.05)。3.牛磺酸可减轻碘海醇刺激HK-2细胞产生的ROS升高,但于本研究浓度范围内无剂量依赖性。以培养基对照组的倍数表示,牛磺酸(3,12,24mmol/L)干预组和碘海醇刺激组的ROS分别为(1.12±0.12)倍,(1.11±0.15)倍,(1.12±0.10)倍比(1.29±0.09)倍(P<0.05)。4.牛磺酸可上调Bcl-2表达(P<0.05),Bax表达各组无变化(P>0.05)。结论在一定浓度范围内,牛磺酸能呈剂量依赖性保护体外培养的HK-2细胞,减轻碘海醇诱导的细胞损伤及凋亡,其部分保护机制可能与减轻细胞内氧化应激、促进Bcl-2表达上调有关。