论文部分内容阅读
黄酮类化合物对人体健康的益处正得到越来越多的关注。但是，从植物中提取高纯度的黄酮类化合物目前仍然受成本、季节和植物中某些天然黄酮含量较低等因素的限制。此外，化学合成法一般伴随有毒副产物的积累，且需要高温高压等极端的反应条件。因此，使用代谢工程改造微生物合成黄酮类化合物备受研究者的关注。圣草酚作为一种黄酮类化合物，具有抗炎和抗氧化的功效。圣草酚在大肠杆菌中的高效合成面临两个主要障碍：细胞色素P450单加氧酶的低水平表达和胞内低浓度的丙二酰辅酶A。为了解决这两个问题，将截短的植物P450黄酮3’羟化酶(tF3’H)与截短的P450还原酶(tCPR)在大肠杆菌(Escherichia coli)中融合表达。这使得共表达此融合蛋白和酪氨酸解氨酶(TAL)，4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)，査尔酮合成酶(CHS)以及查尔酮异构酶(CHI)的大肠杆菌重组菌株能够从L-酪氨酸直接合成圣草酚。另外，通过代谢工程技术强化丙二酰辅酶A合成途径并平衡相应基因的表达可进一步提高圣草酚的积累。本研究主要成果如下：(1)通过代谢工程技术强化了丙二酰辅酶A合成途径，使重组菌胞内丙二酰辅酶A含量达到3.98±0.16μmol g-1DCW，比野生菌提高了1630%。(2)通过对蛋白质二级结构的分析，确定了来自非洲菊(Gerbera hybrid)的黄酮3’羟化酶(F3’H)的N端膜结合部分，使用PCR技术切除膜结合部分后，与来自长春花(Catharanthus roseus)的P450还原酶(tCPR)构建融合基因。此方法通过可溶性表达黄酮3’羟化酶，实现了在大肠杆菌中以L-酪氨酸为底物的圣草酚合成。(3)通过适当的发酵优化和控制，研究不同诱导温度、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的浓度和IPTG诱导时机对大肠杆菌合成圣草酚的影响。通过发酵优化和控制，工程菌株BF1、BF2、BMF1和BMF2最高产量分别达到35.2mg L-1、42.6mg L-1、86.4mg L-1和107mg L-1。