1．研究背景股骨头坏死（Osteonecrosis of the Femoral Head，ONFH）是由不同病因引起的股骨头有活力成分死亡的病理过程，临床以髋关节疼痛、功能障碍为主要症状。股骨头坏死的发病率正逐年上升，目前我国的发病人数已达700万，每年新发病例数约为20万。糖皮质激素在临床上是不可或缺的药物，由之诱发的股骨头坏死也逐年增多，目前其发病率已超过创伤性股骨头坏死，成为股骨头坏死的最主要发病因素。激素性股骨头坏死的治疗是医学界的一大难题。目前还没有一种确切有效的股骨头坏死治疗方法。如果能在股骨头坏死的发病前期及时消除或阻断致病因素的作用和累积影响，阻止该病的发生，将是最积极、最有效的治疗措施。祖国医学典籍中无股骨头坏死这一病名的直接记载，但根据其症状、体征与发病机理，多数学者认为归属于“骨痹”与“骨痿”等范畴。激素使用后，正气损伤，脾胃虚弱，运化失司，水湿内停，聚而成痰，“由痰致瘀，因瘀致痹”。此外，过量应用激素可致肾虚，肾气亏损，气滞血行不畅，血瘀闭阻经脉；筋骨失养，骨枯髓空而为病，发为“骨痿”。现代医学认为激素所致的血中脂质代谢紊乱与血管内凝血是激素性股骨头坏死发病的重要机理。现已公认高血脂为中医痰浊的生化物质基础；血液高凝状态所引起的血管内凝血及微循环障碍与中医“瘀”相关。然而，单纯活血化瘀法治疗股骨头坏死的疗效并不明显，研究表明，大量活血药的应用可能损伤血管内皮细胞，加重股骨头坏死。导师陈卫衡主任医师经过多年的研究，指出“痰瘀”可能是股骨头坏死的病理转归和核心，由痰致瘀，因瘀致痹。因而在治疗上提出“痰瘀同治”，采用健脾化痰、活血通络法治疗激素性股骨头坏死，取得较独特的疗效。补肾中药可以对抗激素对骨的部分不利作用，促进骨基质的合成，补肾壮骨、活血通络法为临床治疗股骨头坏死的常用治法，在临床上也取得一定的疗效。本课题从“治未病”思想出发，复制符合人类股骨头坏死发病特点的动物模型，并在造模的同时，分别采用健脾化痰、活血通络和补肾壮骨、活血通络两种不同的治法对其进行预防，从而研究比较两种不同治法对激素性股骨头坏死预防的作用效果及机理，探讨中药调节脏腑功能对激素致股骨头坏死形成的影响及其预防途径和作用靶点，为在临床对该病高危人群实施早期预防提供理论依据和应用指导。2．研究目的通过单纯糖皮质激素肌注方法建立符合人类股骨头坏死发病特点的鸡激素性股骨头坏死模型，研究鸡激素性股骨头坏死发生的病理机制，比较健脾化痰、活血通络和补肾壮骨、活血通络两种不同治法对激素性股骨头坏死的预防作用、作用机制，及两种不同治法的作用特点，为在临床对该病高危人群实施预防提供理论依据和应用指导。3．研究方法3．1动物分组与给药健康成年来航鸡80只，随机分为5组：正常组，模型组，阳性组，健脾化痰、活血通络组（简称健脾组），补肾壮骨、活血通络组（简称补肾组）。正常组灌胃蒸馏水5ml／kg·d，胸肌注射生理盐水0.125ml／kg，每周一次；模型组参照王新生造模方法并结合前期实验研究结果，选用甲基氢化泼尼松琥珀酸钠为造模剂，采用单纯糖皮质激素肌注方法造模，按5.2mg／kg体重胸肌内注射造模剂甲基氢化泼尼松琥珀酸钠，每周一次，并灌胃蒸馏水5ml／kg·d；阳性组在使用造模剂的同时每日灌胃洛伐他汀，4ml／kg·d；健脾组在使用造模剂的同时给予健脾化痰、活血通络中药，6ml／kg·d；补肾组在使用造模剂的同时给予补肾壮骨、活血通络中药，9ml／kg·d。所有动物予以青霉素2万u／kg、链霉素50mg／kg肌注，2次／周，以预防感染。3．2血液学检测于给药的第4、8、12、16周，动物禁食8小时以上，空腹取静脉血，测定总胆固醇（CHO）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白（HDL）与低密度脂蛋白（LDL）等血脂指标。于给药的8、16周静脉取血，测定纤维蛋白原（FIB）、活化部分凝血酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、凝血酶原时间（PT）等凝血功能指标与纤溶酶（PLG）、抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）、组织型纤溶酶原激活物（t-PA）等纤溶相关指标。3．3组织病理学观察于给药8、16周分批断颈处死动物，在无菌、无RNA酶的条件下取双侧股骨头，股骨头组织石蜡切片常规HE染色，光镜下观察股骨头内软骨细胞、骨细胞、骨小梁、髓腔脂肪细胞形态、结构变化；在高倍镜下任选5个视野，每个视野内计数50个骨陷窝，求出空骨陷窝的百分比。石蜡切片行Masson染色，光镜下观察软骨及骨小梁内胶原分布情况；采用图像分析技术分析骨内空骨陷窝率、脂肪面积，胶原面积比。3．4分子生物学检测用免疫组织化学方法检测股骨头组织内TGFβ₁、BMP₂、Smad₄、Smad₇、VEGF等细胞因子的蛋白含量；用组织原位杂交方法检测骨组织内OPG与RANKL mRNA的表达情况，采用图像分析技术，计数阳性细胞，分析光密度值。3．5统计方法采用SPSS13.0软件数据进行统计分析，组间计量资料数据比较采用单因素方差分析，两组间股骨头坏死率的比较采用卡方检验；计量资料数据以均数±标准差（（?）±S）表示，P＜0.05为有统计学意义。4．研究结果4．1一般形态观察正常组动物体重下降幅度较小，于第2周恢复至实验前水平，各种体征表现正常。模型组动物自给药第2周开始体重持续下降，8周取材时股骨头外观未见明显异常，16周时有2例股骨头出现股骨头软骨下骨塌陷，部分股骨头骨质疏松易凿切，骨髓脂肪增多。阳性组动物体重自给药第2周开始下降，股骨头外观接近正常组。健脾组动物体重无明显下降，股骨头外观接近正常组。补肾组动物在给药1～6周体重下降，自6周以后状态逐渐改善，15周末体重接近给药前水平，股骨头外观接近正常组。4．2病理组织学观察4．2．1 HE染色正常组：股骨头软骨表面光滑，软骨细胞排列整齐；股骨头内骨小梁排列规则整齐、致密饱满，周边可见成骨细胞和少量破骨细胞；第8、16周时空骨陷窝率分别为9.5％、9.6％；髓腔内各种血细胞丰富，未见脂肪细胞增生及肥大。模型组：股骨头软骨表面粗糙，部分软骨细胞呈簇状肥大，排列不规则；8周时股骨头内骨小梁稍稀疏，空骨陷窝增多，空骨陷窝率达23.3％，与正常组相比有显著差异（P＜0.05），骨小梁周边成骨细胞较少，破骨细胞增多；骨髓内脂肪细胞明显增生、肥大，造血细胞减少，髓内脂肪面积较正常组明显增多（P＜0.05）。16周时股骨头内骨小梁稀疏，部分有断裂，空骨陷窝明显增多，空骨陷窝率为27.7％，与正常组相比有极显著差异（P＜0.01）；部分区域骨小梁全部坏死，伴有增生现象；髓腔内脂肪细胞增生、肥大，融合成大片空泡状，脂肪面积较正常组明显增多（P＜0.01）。阳性组：软骨细胞排列欠规则，骨小梁稀疏，破骨细胞活跃，空骨陷窝较多，给药8周空骨陷窝率为16％，明显低于模型组（P＜0.05），给药16周空骨陷窝率为21％，与模型组相比无显著性差异（P＞0.05）。髓腔内脂肪面积明显少于模型组，给药8周有极显著性差异（P＜0.01），给药16周有显著性差异（P＜0.05）。健脾组：软骨细胞排列整齐；骨小梁排列尚规则、致密，周边可见大量成骨细胞及少量破骨细胞；骨小梁内有少量空骨陷窝，给药8周空骨陷窝率为15.2％，给药16周空骨陷窝率为17％，均明显低于模型组（P＜0.05），与正常组相比均未见明显差异（P＞0.05）。髓腔内造血细胞丰富，脂肪细胞较少，与模型组相比，给药8周、16周髓内脂肪面积均明显减少（P＜0.01）。补肾组：8周时与健脾组病理表现相似，给药16周股骨头内骨小梁较健脾组致密、饱满，坏死区周边可见成骨细胞包绕及类骨质形成；给药8周空骨陷窝率为18％，与模型组及正常组相比无明显差异（P＞0.05）；给药16周空骨陷窝率为15％，明显少于模型组（P＜0.05）；髓腔内脂肪泡零散分布，髓腔内造血细胞较丰富；在给药8周、16周髓内脂肪面积均比模型组明显减少（P＜0.01）。4．2．2 Masson染色模型组绿色染色较正常组明显增多，软骨有退变表现。阳性组、健脾组、补肾组骨小梁内绿染较模型组减少（P＜0.05）。4．2．3股骨头坏死发生率及病理分级情况在本实验中，正常组无一例出现股骨头坏死；模型组于给药8周、16周股骨头坏死发生率分别为75％（12／16）、87.5％（14／16），均明显高于正常组（P＜0.01）。给药8周时，阳性组、健脾组没有发现股骨头坏死，补肾组股骨头坏死率为6.25％（1／16），明显低于模型组（P＜0.01），病理分级均为Ⅰ级。给药16周时，补肾组没有发现股骨头坏死，阳性组坏死率为43.75％（7／16），与模型组相比无明显差异（P＞0.05）；健脾组坏死率为6.25％（1／16），明显低于模型组（P＜0.01）。4．3血液学研究4．3．1血脂模型组：与正常组相比，模型组动物血清CHO、TG、LDL在给药的4、8、12、16周时均明显升高（P＜0.05或P＜0.01），HDL降低，以12、16周时明显（P＜0.05）。阳性组：给药4、8、12、16周时血清CHO、TG、LDL均明显低于模型组（P＜0.01或P＜0.05），与健脾组、补肾组相比无显著性差异（P＞0.05）。健脾组：给药4、8、12、16周时血清CHO、TG、LDL均明显低于模型组（P＜0.05），HDL高于模型组，以12周时明显（P＜0.05），给药的16周TG明显低于补肾组（P＜0.05）。补肾组：与模型组相比，给药4周时血清CHO、TG、LDL水平未见明显差异（P＞0.05）；给药8、12、16周时血清CHO、TG、LDL均明显降低（P＜0.05），HDL高于模型组，以12周时明显（P＜0.05）。4．3．2凝血系统模型组：与正常组相比，给药8、16周模型组动物FIB升高（P＜0.05），APTT、PT缩短，以给药8周时明显（P＜0.05），TT在8周时缩短明显（P＜0.05）。阳性组：于给药16周时TT小于模型组（P＜0.05），其余周次相关指标未见明显差异（P＞0.05）。健脾组：与模型组相比，给药8周健脾组FIB明显降低（P＜0.05），PT明显延长（P＜0.01），给药16周APTT、TT延长（P＜0.05），接近正常组水平；给药16周FIB低于补肾组（P＜0.05）。补肾组：与模型组相比，给药16周补肾组FIB明显降低，PT明显延长（P＜0.05），APTT延长（P＜0.01），接近正常组水平。4．3．3纤溶系统模型组：与正常组相比，给药8周，模型组动物t-PA明显降低（P＜0.01）；给药16周，模型组PLG、AT-Ⅲ明显降低（P＜0.05）。阳性组：给药8、16周，PLG、AT-Ⅲ、t-PA较模型组稍降低，但无统计学差异。健脾组：与模型组相比，PLG、AT-Ⅲ、t-PA均升高，第8周时t-PA升高明显（P＜0.05），16周时PLG升高明显（P＜0.05），t-PA明显高于补肾组（P＜0.05）。补肾组：PLG、AT-Ⅲ、t-PA比模型组升高，但无显著性差异（P＞0.05）。4．4鸡股骨头组织内TGFβ1、BMP2、VEGF、Smad4、Smad7的表达模型组：与正常组相比，在给药8周、16周股骨头组织内TGFβ₁、BMP₂、VEGF、Smad₄阳性细胞数明显减少（P＜0.05）、Smad₇阳性细胞数增多（P＜0.05）。阳性组：TGFβ₁、BMP₂、VEGF、Smad₄与模型组相比无显著性差异（P＞0.05）。与模型组相比，健脾组、补肾组内的TGFβ₁、BMP₂、VEGF、Smad₄阳性细胞计数增多（P＜0.05），TGFβ₁、BMP₂、Smad₄的平均OD值升高（P＜0.05）；8周时健脾组TGFβ₁及8、16周时VEGF阳性细胞数均明显高于补肾组（P＜0.05）；16周时补肾组TGFβ₁、BMP₂、Smad₄阳性细胞数明显高于健脾组（P＜0.05或P＜0.01）。4．5鸡股骨头组织内OPG mRNA、RANKL mRNA的表达模型组：在给药8周、16周，与正常组相比，模型组股骨头组织内OPG mRNA的阳性细胞数及平均光密度值（OD）明显降低（P＜0.01），RANKL mRNA的阳性细胞数明显增高（P＜0.01），RANKL mRNA／OPG mRNA比值增大。阳性组：给药8、16周，与正常组相比，阳性组OPG mRNA阳性细胞计数明显减少，RANKL mRNA阳性细胞计数明显增多（P＜0.01）；与模型组相比，16周时RANKLmRNA明显减少（P＜0.05），OPG mRNA无显著性差异（P＞0.05）。给药8、16周，健脾组、补肾组的OPG mRNA阳性细胞数比模型组明显增高（P＜0.01），RANKL mRNA明显减少（P＜0.05），RANKL／OPG比值减小（P＜0.05）。给药8周时，健脾组OPG mRNA阳性细胞数明显多于阳性组和补肾组（P＜0.01），给药16周，补肾OPG mRNA平均OD值明显高于健脾组（P＜0.05）。5．结论5．1采用单纯糖皮质激素肌注方法建立的鸡激素性股骨头坏死模型，能较好反应临床激素性股骨头坏死的病理过程，造模成功率较高。5．2激素性股骨头坏死的发生与激素所致的脂肪代谢紊乱、血栓前状态及凝纤功能紊乱及组织内骨相关基因蛋白表达改变（TGFβ₁、BMP₂、Smad₄、VEGF、OPG mRNA表达下调和Smad₇、RANKL mRNA表达上调）相关。5．3健脾化痰、活血通络与补肾壮骨、活血通络法均对鸡激素性股骨头坏死的发生有预防作用，两者作用效果相近，但作用特点及机理有差别。健脾化痰、活血通络法在调节整体的血脂代谢、凝血功能，尤其是改善纤溶功能、促进股骨头局部TGFβ₁、VEGF的表达等方面有较强作用。补肾壮骨、活血通络法主要通过上调骨形成相关因子（BMP₂、Smad₄、OPG mRNA）的表达，促进骨修复，从而预防激素性股骨头坏死的发生。