实验目的：根据《流式细胞仪配套用检测试剂注册申报资料技术审评指导原则》和《YY/T1184-2010医药行业标准流式细胞仪用单克隆抗体试剂》的要求,评价流式细胞仪用体外诊断试剂的线性范围、精密度、准确度以及特异性的性能评估方法的可行性及优缺点,通过试验完善性能评估方法,进而建立适用流式细胞仪用单抗类体外诊断试剂的性能评估方法。实验方法：1.线性范围方法的评估：(1)通过流式细胞术筛选针对单抗CD19和CD33的阳性和阴性质控细胞系；(2)选择9个浓度水平,每个浓度水平4份复制液,通过分析相应浓度的阳性细胞百分率来评估稀释细胞浓度线性范围；(3)选择经筛选确认的阳性细胞株和阴性细胞株按照恒定的细胞总数将两种绍胞进行不同比率的混合,阳性细胞数与阴性细胞数比例从0%到100%不等,确认合理的阳性细胞百分率的线性范围。2.准确度评价方法的评估：(1)用已知靶值的细胞,使用试剂进行标记,重复检测三次,观察检测值与靶值是否相符,得到试剂的准确度；(2)进行方法学比对,使用待测试剂和对照试剂同时检测40个未知样本,对两种试剂的检测结果做配对样本T检验和相关系数分析,从而得到待检试剂的准确度。3.精密度检测方法的评估：(1)使用骨髓样本,连续检测20个工作日,每天由两人完成2次完整运行,每次运行间隔不少于3小时,结果统计批内精密度和批间精密度,从而获得试剂总精密度；(2)使用商品化质控血,连续检测20个工作日,每天由两人完成2次完整运行,每次运行间隔不少于3小时,结果统计批内精密度和批间精密度,从而获得试剂总精密度；(3)使用骨髓样本,连续检测8个工作日,每天两人共成4次完整运行,每次间隔不少于3小时,结果统计批内精密度和批间精密度,从而获得试剂总精密度。4.特异性检测(1)溶血,将骨髓人为制造不同程度溶血,并对同一来源的未溶血和溶血后的标本进行标记检测,对检测结果进行偏差分析,判断溶血对试剂是否存在干扰；(2)药物,按照地塞米松和柔红霉素使用的方法,对药品进行稀释,添加到未用药病人的骨髓中,使用待测试剂对未添加药物和已添加药物的标本进行检测,检测结果进行偏差分析,评价地塞米松和柔红霉素对试剂是否存在交叉反应；(3)高蛋白,将患有多发性骨髓瘤的病人骨髓,用PBS进行置换,用置换后的样本和未置换的同一人骨髓样本用待测试剂检测,检测结果用偏差分析,判断高蛋白是否对试剂有影响。实验结果：1.(1)筛选REH和HSB2为CD19-APC的质控细胞,HL60和CEM为CD33-PE的质控细胞；(2)通过混合细胞9个浓度的测定,CD19-AI)C每人次的稀释细胞浓度线性范围为6-0.25×106,CD33-PE每人次的稀释细胞浓度线性范围为6～0.5×106；(3)阳性细胞数与阴性细胞数比例从0%到100%不等,确认CD19-APC和CD33-PE百分率的线性范围均为0%到100%。2.(1) CD19-APC检测商品化质控血的结果在靶值范围内,CD33-PE检测商品化质控血的结果超出靶值范围；(2)进行方法学比对,CD19-APC和CD33-PE与对照试剂检测结果进行T检验的P值均大于0.05,相关系数均大于0.95。3.(1)20天内使用骨髓标本检验总精密度时,批内精密度结果阳性百分率与荧光均小于10%,批间精密度中阳性百分率的偏差小于10%,而荧光值的偏差大于10%；(2)使用质控血检测,则批内及批间精密度各项均小于10%；(3)使用骨髓标本进行扩大每天自由度的尝试,进行8天检测,批内精密度结果均小于10%,而批间精密度中,阳性百分率的偏差大于10%,荧光值偏差小于10%。4.(1)溶血,发生溶血时,检测结果偏差大于10%,对此类型的试剂有影响,并且随着溶血程度的加深,对试剂影响变大；(2)药物,加入地塞米松时,检测偏差小于10%,地塞米松对试剂检测无影响,而加入柔红霉素时,检测偏差大于10%,柔红霉素对试剂有影响；(3)高蛋白,置换血浆前后,检测结果偏差小于10%,高蛋白对此类试剂使用无明显影响。实验结论：1.筛选合适的细胞系可以做为质控细胞系,评估单抗类试剂各项指标。利用质控细胞可以评估出单抗类体外试剂的线性,为了真实反映试剂的性能,应给出试剂的稀释细胞浓度线性范围阳性细胞百分率的线性范围。2.商品化的带有靶值的质控血,只能质控少部分试剂,并且受到生产厂家、运输储存条件以及质控血内的细胞稳定性的局限,方法学比对的应用范围更广。3.骨髓标本无法满足长时间的检测需要,质控血使用范围小,需要寻找更好的方法来对试剂的精密度进行评估。4.人为模拟的对标本的破坏以及进行药物或者其他组分的添加,可以对试剂的特异性进行评估,所选取的类型应足够广泛,才能更真实的反应试剂的特异性。