【摘 要】
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长期采食高能、高蛋白日粮饲料产生的活性氧自由基（ROS）易造成母猪性成熟推迟、排卵少、妊娠率低等繁殖力低的现象,制约着我国养猪业健康发展。而在日粮中添加抗氧化剂可有效缓解上述情况的发生。鼠尾草酸（Carnosic acid,CA）具有抗氧化能力强、结构稳定、生产成本低等特点,近些年作为添加剂开始应用于饲料生产中。但有关其影响雌性动物繁殖系统,尤其是卵母细胞成熟及早期胚胎发育的评价相对较少。为此,本
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长期采食高能、高蛋白日粮饲料产生的活性氧自由基（ROS）易造成母猪性成熟推迟、排卵少、妊娠率低等繁殖力低的现象,制约着我国养猪业健康发展。而在日粮中添加抗氧化剂可有效缓解上述情况的发生。鼠尾草酸（Carnosic acid,CA）具有抗氧化能力强、结构稳定、生产成本低等特点,近些年作为添加剂开始应用于饲料生产中。但有关其影响雌性动物繁殖系统,尤其是卵母细胞成熟及早期胚胎发育的评价相对较少。为此,本研究以体外培养的猪卵母细胞、孤雌激活胚胎为研究对象,通过在培养液中添加CA的方式,从细胞抗氧化能力、线粒体功能等角度探讨了CA对卵母细胞成熟和早期胚胎发育的影响。以期通过营养与繁殖调控途径,探索提高母猪繁殖力的技术措施。具体内容如下:为明确CA对猪卵母细胞成熟的影响,本研究基于其他研究结果,在卵母细胞体外成熟培养液中添加10μM的CA,待卵母细胞培养成熟后,首先分别通过面积测量、荧光定量PCR（RT-q PCR）等方法检测了卵丘细胞扩散程度和卵母细胞第一极体排出率的变化。随后,本研究通过荧光染色、化学发光等方法,分别检测了CA添加组和阴性对照组卵母细胞中总ROS水平、谷胱甘肽（GSH）、线粒体膜电位（MMP）和ATP产量的变化。结果表明,CA添加组中卵母细胞第一极体排出率显著高于阴性对照组（p＜0.05）,卵丘细胞的扩散面积增加为阴性对照组的1.51±0.18倍（p＜0.05）,卵丘细胞扩散相关基因HAS2（p＜0.01）和PTX3（p＜0.05）显著上调,但AREG、COX2表达无显著影响（p＞0.05）。同时,CA添加组中卵母细胞内ROS水平降低为阴性对照组的0.76±0.03倍（p＜0.05）,GSH水平、线粒体的MMP水平及产生ATP的能力分别提升为阴性对照组的1.3±0.05倍（p＜0.05）、1.26±0.46倍（p＜0.05）和1.40±0.09倍（p＜0.01）。这些结果表明,10μM的CA可显著提高卵母细胞质量及其成熟率。在明确CA添加可提高体外培养的卵母细胞质量后,为明确CA的添加对猪早期胚胎发育有何影响,本研究在胚胎体外培养液（IVC）中分别添加不同浓度（0μM、5μM、10μM、20μM、50μM）的CA。首先检测了不同阶段胚胎的卵裂率、囊胚率及孵化率变化。随后,通过荧光染色法分别检测了早期孤雌胚胎的总细胞数、细胞凋亡率、ROS水平、GSH水平及MMP水平变化。最后,通过RT-q PCR检测了早期胚胎相关功能性基因表达水平的变化。结果表明,与阴性对照组相比,10μM CA添加组中孤雌激活胚胎的卵裂率、囊胚率、孵化率显著提高（p＜0.05或p＜0.01）。第7天孤雌激活胚胎囊胚期细胞总数显著增加,阴性对照组为59.25±21.36,CA添加组为72.34±23.05（p＜0.01）;并减少细胞凋亡数,阴性对照组细胞凋亡率为6.71±2.85%,CA添加组为3.10±1.71%（p＜0.05）。而在猪胚胎合子基因组激活关键时期的4-细胞阶段,CA添加组胚胎的ROS水平下降为阴性对照组的0.81±0.23倍（p＜0.01）,GSH和MMP水平分别上升为阴性对照组的1.41±0.24倍（p＜0.01）和1.34±0.48倍（p＜0.01）。此外,CA的添加上调了囊胚中NANOG、SOX2、GATA4、COX2、ITGA5和RICTOR的表达水平（p＜0.05或p＜0.01）,并下调促凋亡相关基因BIRC5（p＜0.05）和Caspase 3（p＜0.01）的表达水平。这些结果表明,10μM的CA具有通过提高抗氧化能力从而促进孤雌激活胚胎发育的作用。综上所述,CA通过改善细胞内抗氧化能力从而促进卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育。重要的是,CA可以增强线粒体功能,调控胚胎多能性基因表达。但相应结果也表明,过量的CA（25μM以上）会抑制胚胎发育。研究结果为深入了解CA的生物学作用、解析其分子调控机制及其作为饲料添加剂的开发利用提供了理论依据。
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