肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS）以及细胞因子的激活在左室重塑和慢性心力衰竭（chronic heart failure, CHF）进展中起重要作用。而在细胞因子的网络调控中,脂联素（adiponection, APN）等细胞因子在心衰过程中起着重要的作用,它使心衰过程中多种细胞因子的交互作用变得复杂,因而积极探索RAAS与APN在CHF中的关系,可能为心衰的临床治疗另辟蹊径提供依据。血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ, AngⅡ）是RAAS系统的主要活性效应分子,在心室重构、CHF的发生发展过程中起着重要作用。其主要生物效应包括诱导心肌细胞肥大、凋亡,促进心肌纤维化等。AngⅡ的生物学作用是通过AngⅡ1型受体（AT₁）和AngⅡ2型受体（AT₂）介导的。这两种受体均属于G蛋白偶联受体,但组织分布以及细胞内信号转导途径是不相同的。AngⅡ与AT₁受体结合可引起心肌肥厚和细胞外基质蛋白的积聚、促进醛固酮分泌等,而AngⅡ与AT₂受体结合则起与AT₁受体结合相反的作用,可使血管扩张、抗平滑肌细胞增殖和参与组织修复等起到保护作用。已有研究证实在心室肥厚、心肌梗死以及心力衰竭时AT₂受体表达相对上调,介导AngⅡ的主要作用。AT₂受体在肥大心肌细胞下游的信号转导通路主要有以下4条:磷脂酶C途径、NO/CGMP途径、Rho途径、JAK/STAT_途径。AngⅡ与AT₂受体结合后可激活其下游的NO-CGMP信号转导通路,CGMP可通过CGMP依赖的蛋白激酶（PKG）发挥扩张血管、抗平滑肌细胞增殖、利钠等心血管保护作用。APN是主要由脂肪细胞分泌的一种细胞因子,近几年的研究显示,心肌细胞也能合成、分泌APN,心肌细胞分泌的APN可通过自分泌和旁分泌方式调节心脏功能和心肌代谢。许多研究表明APN水平在CHF患者中呈明显升高且主要来源于心脏,升高程度与心脏疾病的严重程度呈正相关。还有研究表明心外脂肪可能是APN的来源之一,但心力衰竭时心肌细胞分泌的APN是否是血清APN的来源之一目前国内外还没有文献报道。最近研究证实AngⅡ可通过激活AT₂受体上调脂肪细胞APN的表达,AT₁受体在此过程中不被激活。ANP和BNP是心肌细胞合成和分泌的肽类物质,文献报道二者在心力衰竭时升高,其升高的血浆水平与血浆APN水平呈显著正相关,APN在CHF中具有与BNP相似并相互协调的作用。Tsukamoto等研究证实ANP和BNP可与脂肪细胞表面受体结合,催化细胞内第二信使cGMP的合成,通过CGMP/PKG信号转导途径诱导脂肪细胞APN表达。在自发性高血压大鼠血红素的上调升高血浆CGMP水平同样能诱导血浆APN水平的上调。基于以上实验及临床依据,我们推测AngⅡ可能通过AT₂/NO/cGMP/PKG信号转导系统促进心肌细胞APN表达,在心力衰竭患者神经内分泌改变中发挥着作用。CHF的动物模型有许多种,异丙肾上腺素诱导的CHF模型因其方法简单,费用低廉以及临床上与心肌梗死、心力衰竭、心室重构极其相似的的病理生理和分子生物学特征在临床以及实验研究中得到广泛应用。急性心肌梗死后心室重构是临床上常见的进行性发展的病理生理过程。大鼠皮下注射异丙肾上腺素可剂量依赖性的造成心肌片状或弥漫性坏死,而其冠状动脉却不受任何影响。有研究表明,大鼠皮下注射异丙肾上腺素后病理生理学及形态学的变化与人心肌梗死后的改变极其相似。心肌梗死后导致非对称性左室重构,梗死区的心肌纤维化、变薄,非梗死区心肌反应性增厚,心肌节段变长,使左心室进行性扩张和左心室功能进行性下降,最终导致心力衰竭或猝死的发生。APN具有降糖、抗炎、抗动脉粥样硬化作用,近年研究表明可抑制压力负荷大鼠心肌肥厚的发生。已知TNF-α也可由心室肌细胞合成和分泌,心肌细胞分泌的TNF-α可以抑制APN及AdipoR1基因的表达,并也可通过自分泌和旁分泌方式诱导心肌细胞凋亡、心肌纤维化继发炎症反应等在压力负荷大鼠心脏心室重构、心功能异常过程中发挥重要作用。已知血管紧张素1型受体系统在调节血压以及高血压引起的一系列病理过程包括心室重构中起着重要作用。血管紧张素受体拮抗剂通过阻断1型受体可减小心肌梗死面积、改善心功能等。替米沙坦是AT₁受体拮抗剂,除了能高效、特异地阻断AngⅡ1型受体,在受体水平阻断AngⅡ的对心血管系统的负性作用外,近年研究表明还具有过氧化物酶体增殖物活化受体γ（peroxISOme proliferator -activated receptorγ,PPARγ）激动剂的活性。临床上广泛用于高血压、CHF、糖尿病肾病等的治疗。近年研究发现,替米沙坦可通过激活PPAR-γ调节糖脂代谢、抑制炎性因子TNF-α等的表达起到改善心室功能、抑制梗死后心室重构作用;替米沙坦可通过激活PPAR-γ以剂量-时间依赖方式增强脂肪组织APN的表达和分泌。ARB还可通过诱导心肌APN的表达抑制病毒性心肌炎大鼠的心室重构。但替米沙坦对ISO诱导的心肌重构的保护作用是否与心肌APN表达有关还没有文献报道。本研究以培养的新生SD大鼠心肌细胞为研究靶细胞,观察AngⅡ诱导的心肌细胞APN表达的变化;并探讨AT₂R/NO/cGMP/PKG信号转导系统在AngⅡ诱导大鼠心肌细胞APN表达过程中的可能作用。以ISO诱导心肌细胞作为损伤心肌细胞模型,ISO皮下注射构建心肌损伤后心室重构大鼠模型,分别在体外细胞水平和动物整体水平探讨替米沙坦抑制损伤后心室重构作用与心肌APN表达的关系,并对其细胞分子生物学机制进行深入探讨,旨在为临床诊治心力衰竭提供新的理论和实验依据。实验内容主要包括以下四部分:第一部分AngⅡ对心肌细胞APN表达的影响目的:观察AngⅡ对心肌细胞APN表达的影响,探讨AngⅡ受体在其中的作用。方法: （1）采用胰酶消化法和差速贴壁分离法获取新生大鼠心肌细胞,α-肌动蛋白免疫荧光法进行细胞鉴定。（2）应用实时定量逆转录-聚合酶链反应法（Real-time PCR）、Western Blot方法检测不同处理组心肌细胞APN mRNA和蛋白的表达量。结果:1 AngⅡ对心肌细胞APN mRNA表达的浓度依赖性:与对照组相比,AngⅡ（10-8、10-7、10-6 mol/L）作用心肌细胞24 h,APN mRNA表达量明显增加（P<0.05）,10-7 mol/L时达高峰（P<0.01）,10-6 mol/L、10-8 mol/L时APN mRNA表达量均低于10-7 mol/L组（均P<0.01）。2 AngⅡ对心肌细胞APN mRNA表达的时间过程:在无血清白蛋白培养的心肌细胞培养液中加入10-7 mol/L AngⅡ后0、2、4、8、12、24、48、72 h分别测定心肌细胞APN mRNA表达水平。结果显示:对照组（0 h）心肌细胞表达少量的APN mRNA,给予AngⅡ2 h后,APN mRNA表达量开始增加（P<0.05）,24 h达高峰（P<0.05）,当时间延长至48 h、72 h时,APN表达量有下降趋势,但仍明显高于对照组水平（均P<0.05）。3 AngⅡ1型受体拮抗剂telmisartan （telm）在AngⅡ诱导心肌细胞APN mRNA表达中的作用:与10-7 mol/L AngⅡ组相比,10-7 mol/L AngⅡ+10-5mol/L telm组心肌细胞APN mRNA水平显著增加（P<0.05）;与对照组相比,10-5 mol/L telm组心肌细胞APN mRNA水平明显增加（P<0.05）。4 AngⅡ2型受体拮抗剂PD123319在AngⅡ诱导心肌细胞APN mRNA表达中的作用:与10-7 mol/L AngⅡ组相比,10-7 mol/L AngⅡ+10-5 mol/L PD123319组心肌细胞APN mRNA水平明显降低（P<0.05）;10-5 mol/L PD123319组心肌细胞APN mRNA的水平与对照组相比无显著差异（P>0.05）。5 PD123319在AngⅡ诱导心肌细胞APN蛋白表达中的作用:与10-7 mol/L AngⅡ组相比,10-7 mol/L AngⅡ+10-5mol/L PD123319组心肌细胞APN蛋白水平明显降低（P<0.05）;10-5 mol/L PD123319组心肌细胞APN蛋白的水平与对照组相比无显著差异（P>0.05）。结论: AngⅡ可上调心肌细胞APN的表达,且此作用可能是通过AT₂R介导的。第二部分NO/CGMP信号转导系统在AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞APN表达中的作用目的:观察NO/CGMP信号转导系统在AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞APN表达中的作用方法:应用实时定量逆转录-聚合酶链反应法（Real-time PCR）、Western Blot方法检测各处理组心肌细胞APN mRNA和蛋白的表达量。结果:1 NO合成抑制剂L-NAME在AngⅡ诱导心肌细胞APN mRNA表达中的抑制作用:与10-7 mol/L AngⅡ组相比,10-7 mol/L AngⅡ+10-3 mol/L L-NAME组心肌细胞APN mRNA水平明显降低（P<0.05）;10-3 mol/L L-NAME组心肌细胞APN mRNA水平与对照组相比无显著差异（P>0.05）。2 cGMP拮抗剂类似物Rp-8-Br-CGMP-S在AngⅡ诱导心肌细胞APN mRNA表达中的抑制作用:PCR结果表明,与10-7 mol/L AngⅡ组相比,10-7 mol/L AngⅡ+10-5 mol/L Rp-8-Br-CGMP-S组心肌细胞APN mRNA水平明显降低（P<0.05）;10-5 mol/L Rp-8-Br-CGMP-S组心肌细胞APN mRNA水平与对照组相比无显著差异（P>0.05）。3 NO供体SNP对心肌细胞APN mRNA表达的影响:与对照组相比,SNP（10-6、10-5、10-4 mol/L）作用心肌细胞24 h,心肌细胞APNmRNA表达量较对照组明显增加,且呈剂量依赖性（P<0.05、P<0.01和P<0.01）,10-4 mol/L SNP组的APN mRNA水平明显高于10-5 mol/L和10-6 mol/L SNP组（P<0.05）。4 cGMP激动剂8-Br-cGMP对心肌细胞APN mRNA表达的影响:与对照组相比,8-Br-cGMP（10-6、10-5、10-4 mol/L）作用心肌细胞24 h,心肌细胞APN mRNA表达量较对照组明显增加,且呈剂量依赖性（P<0.05、P<0.01和P<0.01）,10-4 mol/L SNP组的APN mRNA水平明显高于10-5 mol/L和10-6 mol/L SNP组（P<0.05）。5 Rp-8-Br-CGMP-S在AngⅡ诱导心肌细胞APN蛋白表达的抑制作用: Western Blot结果表明,与10-7 mol/L AngⅡ组相比,10-7 mol/L AngⅡ+10-5 mol/L Rp-8-Br-CGMP-S组心肌细胞APN蛋白表达量明显降低（P<0.05）;10-5 mol/L Rp-8-Br-CGMP-S组心肌细胞APN蛋白表达量与对照组相比无显著差异（P>0.05）。结论: AngⅡ可能通过AT₂R/NO/CGMP/PKG信号转导途径上调心肌细胞APN的表达。第三部分AngⅡ1型受体拮抗剂替米沙坦对ISO诱导的大鼠心肌细胞APN的影响目的:观察替米沙坦对ISO诱导的受损大鼠心肌细胞的保护作用,探讨此保护作用与APN表达的关系。方法:大鼠心肌细胞用替米沙坦、ISO和选择性PPAR-γ拮抗剂GW9662单独或联合处理,MTT法观察细胞活力,乳酸脱氢酶（LDH）法检测细胞膜通透性及完整性,流式细胞术测定细胞凋亡状态, Western Blot方法检测心肌细胞APN蛋白的表达量。结果:1替米沙坦对受损心肌细胞活力的影响ISO（10μmol/L）孵育心肌细胞48 h,心肌细胞活力较对照组显著下降（P < 0.01）;而以Telm （5、10、20μmol/L）预处理心肌细胞1 h,再加入ISO共同孵育48 h,10、20μmol/L浓度组心肌细胞活力较ISO组明显增强（P<0.01）,20μmol/L浓度组心肌细胞活力增强最明显（P<0.01）。（Figure 1）。说明Telm能有效拮抗ISO诱导的心肌细胞死亡,并呈剂量依赖性。2替米沙坦对受损心肌细胞细胞膜通透性的影响ISO（10μmol/L）孵育心肌细胞48 h,心肌细胞外液LDH水平较对照组显著上升（P < 0.01）;而以Telm （5、10、20μmol/L）预处理心肌细胞1 h后,再加入ISO共同孵育48 h,各浓度组细胞外液LDH水平均较ISO组明显下降（P < 0.01）,20μmol/L浓度组降低最明显（P < 0.01）。（Figure 2）。说明Telm能有效保护ISO导致的膜损伤,并呈剂量依赖性。3替米沙坦对受损心肌细胞凋亡率的影响ISO（10μmol/L）孵育心肌细胞48 h,心肌细胞凋亡率较对照组显著上升（P < 0.01）;而以Telm （5、10、20μmol/L）预处理心肌细胞1 h后,再加入ISO共同孵育48 h,各浓度组心肌细胞凋亡率均较ISO组明显下降（P < 0.01）,20μmol/L浓度组降低最明显（P < 0.01）。（Figure 3）。说明Telm能有效抑制ISO诱导的心肌细胞凋亡,并呈剂量依赖性。4 Western blot检测APN的蛋白表达结果显示:与对照组比较,ISO（10μmol/L）组心肌细胞APN蛋白表达显著减少（P < 0.01）;与ISO（10μmol/L）组比较,Telm（20μmol/L）+ISO（10μmol/L）组APN蛋白表达显著升高（P < 0.01）;而与ISO（10μmol/L）+Telm（20μmol/L）组比较,Telm（20μmol/L）+ISO（10μmol/L）+GW9662 （30μmol/L）组APN蛋白表达显著减少（P>0.05）。（Figure 4）。说明GW9662能拮抗替米沙坦对受损心肌细胞APN蛋白表达的上调作用。5选择性PPAR-γ拮抗剂GW9662在Telm保护ISO诱导的心肌细胞损伤中的作用5.1与ISO（10μmol/L）+Telm（20μmol/L）组比较, Telm（20μmol/L） +ISO（10μmol/L）+GW9662（30μmol/L）组心肌细胞活力显著下降（P>0.05）;与ISO（10μmol/L）组比较,Telm（20μmol/L）+ISO（10μmol/L）+ GW9662（30μmol/L）组心肌细胞活力无显著变化（P>0.05）。（Figure 5）。说明GW9662能拮抗替米沙坦对受损心肌细胞活力的影响。5.2与ISO（10μmol/L）+Telm（20μmol/L）组比较, Telm（20μmol/L）+ISO （10μmol/L）+GW9662（30μmol/L）组心肌细胞外液LDH水平显著下降（P > 0.05） ;与ISO（10μmol/L）组比较, Telm（20μmol/L）+ISO （10μmol/L）+ GW9662（30μmol/L）组心肌细胞外液LDH水平无显著变化（P>0.05）。（Figure 6）。说明GW9662能拮抗替米沙坦对受损心肌细胞细胞膜的保护作用。5.3与ISO（10μmol/L）+Telm（20μmol/L）组比较, Telm（20μmol/L）+ISO （10μmol/L）+GW9662（30μmol/L）组心肌细胞凋亡率显著下降（P>0.05）;与ISO（10μmol/L）组比较,Telm （20μmol/L）+ISO（10μmol/L） +GW9662（30μmol/L）组心肌细胞凋亡率无显著变化（P>0.05）。（Figure 7）。说明GW9662能有效拮抗替米沙坦对受损心肌细胞凋亡的抑制作用。结论:替米沙坦对ISO诱导的受损大鼠心肌细胞具有的保护作用,其机制可能与激活能启动APN表达的PPAR-γ有关。第四部分替米沙坦对异丙肾上腺素诱导的大鼠心室重构过程中心肌APN的影响目的:观察替米沙坦对ISO诱导的大鼠心室重构的保护作用,探讨此保护作用与心肌APN表达的关系。方法:40只雄性Wistar大鼠随机分为4组:空白对照组、ISO模型组,替米沙坦+ISO组,替米沙坦组,每组10只。除空白对照组及替米沙坦组外,其余两组皮下注射异丙肾上腺素（80 mg/kg/次）连续2次构建大鼠心肌梗死后心室重构模型。连续给药8 wk后,分别检测各组大鼠体重（BW）、心脏重量（HW）,左室重量（LVW）,计算心脏重量指数（HW/BW）、左室重量指数（LVW/BW）;测定左室收缩压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、左心室压力上升及下降最大速率（±dp/dtmax）等指标;取心肌组织作病理学检测;免疫组化、Western Blot、Real-time PCR方法检测心肌APN、TNF-α的表达量。结果:1替米沙坦对ISO诱导的大鼠左室和心脏重量指数的影响与空白对照组比较,ISO模型组HW/BW、LVW/BW明显升高（P<0.05,P< 0.01）;与ISO模型组相比,替米沙坦+ISO组HW/BW、LVW/BW明显降低（P<0.05, P<0.01）;与空白对照组比较,替米沙坦组上述指标无显著改变（P>0.05）。2替米沙坦对ISO诱导的大鼠血流动力学参数的影响与空白对照组比较, ISO模型组LVEDP明显升高（P<0.01）,而LVSP和±dp/dtmax明显下降（P<0.05,P<0.01）;与ISO模型组比较,替米沙坦+ISO组LVEDP明显下降（P<0.05）, LVSP和±dp/dtmax明显升高（P<0.05, P<0.01）;与空白对照组比较,替米沙坦组上述指标无显著改变（P>0.05）。3替米沙坦对ISO诱导的大鼠心肌肥厚及间质纤维化的影响与空白对照组比较, ISO模型组MD、CVF明显升高（P<0.05）;与ISO模型组比较,替米沙坦+ISO组心肌细胞MD、CVF明显下降（P<0.05）;与空白对照组比较,替米沙坦组上述指标无显著改变（P>0.05）。4免疫组织化学染色法检测替米沙坦对APN、TNF-α蛋白表达的影响对照组APN表达量较高,TNF-α表达量很少,ISO组APN阳性染色细胞数明显减少、TNF-α阳性染色细胞数明显增多,主要分布于胞质中,说明ISO能显著抑制APN、促进TNF-α表达;与ISO组比较,替米沙坦+ISO组APN阳性染色细胞数明显增多,TNF-α阳性染色细胞数明显减少,说明替米沙坦能够逆转ISO诱导的TNF-α上调和APN的下调。5 Western Blot法检测替米沙坦对APN、TNF-α蛋白表达的影响与空白对照组比较,ISO模型组APN蛋白表达明显下降（P<0.01）、TNF-α表达明显升高（P<0.05）;与ISO模型组比较,替米沙坦+ISO组APN蛋白表达明显升高（P<0.01）、TNF-α表达明显下降（P<0.05）;与空白对照组比较,替米沙坦组上述指标无显著改变（P>0.05）。6 Real-time PCR法检测替米沙坦对APN、TNF-αmRNA表达的影响与空白对照组比较,ISO模型组APN mRNA表达明显下降（P<0.01）、TNF-αmRNA表达明显升高（P<0.05）;与ISO模型组比较,替米沙坦+ISO组APN mRNA表达明显升高（P<0.01）、TNF-αmRNA表达明显下降（P<0.05）;与空白对照组比较,替米沙坦组上述指标无显著改变（P>0.05）。结论:替米沙坦对ISO诱导心梗后大鼠心室重构具有的抑制作用,其机制可能与APN表达上调有关。