肿瘤是一种多步骤基因组改变的疾病。至目前,对肿瘤基因组的研究主要关注的是蛋白编码基因,而对有功能的非编码序列之改变的认识很缺乏。miRNA是近年发现的一类内源性的、非编码RNA分子,长约22个核苷酸,调控转录后的翻译,并已被证实参与许多诸如细胞分化、增值等过程。据估计,在人类基因组中约有1000个miRNA,尽管要去确切地认定某个miRNA的目标基因还有困难,用计算机预测人类1／3的蛋白编码基因受miRNA调控,这提示miRNA与人类的很多疾病相关,包括肿瘤。的确,随着近五年的深入研究,miRNA对肿瘤基因的调节作用已成为肿瘤生物学一新领域。也有报道,miRNA可能是比蛋白编码基因更为有力的指标用以区分正常与肿瘤组织。尤其值得关注的是lethal-7(let-7),于九十年代在人和鼠中被发现。也有报道,1et-7可作为诸如肺癌、大肠癌等疾病中的一个新的肿瘤抑制基因候选者。胃癌(Gastric carcinoma)是危害人类健康最常见的恶性肿瘤,据WHO报告,全世界每年约有765000人死于胃癌,每年新发病例925000,患者数达3715000。我国胃癌死亡率与其他国家相比处于较高水平达25.16／10万,占恶性肿瘤死亡之首为23%。非典型性增生是公认的癌前病变,慢性胃炎-胃黏膜萎缩-肠化生-不典型增生-胃癌这一演进模式已为国内外多数学者认同。在本研究中用原位杂交检测let-7a在胃粘膜、慢性萎缩性胃炎、胃癌中的表达。实验还显示了慢病毒携带的短发夹RNA能特异地、稳定地、有效地在体内、外表达let-7a,并能快速、有效地用于基因功能分析。最后以蛋白组学技术分析了let-7a过表达后胃癌细胞蛋白表达的改变,以发现let-7a影响胃癌细胞SGC-7901的相关功能蛋白,探讨其在胃癌细胞中产生作用的分子机制。本实验为.let-7a治疗胃癌提供新的实验和理论依据,指导进一步的临床应用。实验内容包括以下五部分：第一部分let-7a在胃粘膜、慢性萎缩胃炎、胃癌组织中的表达及其意义目的：研究let-7a在胃粘膜、慢性萎缩性胃炎、胃癌组织中的表达,并分析其表达强度与胃粘膜癌变演进的关系。方法：原位杂交法检测组织芯片上11例正常胃粘膜、17例慢性萎缩性胃炎、52胃癌组织中let-7a的表达,分析三者阳性率及表达强度差异性。结果：let-7a在正常胃粘膜中(10例阳性)、慢性萎缩性胃炎(15例阳性)、胃癌组织(43例阳性)中的阳性表达率差异无显著性(P>0.05),而表达强度随着胃粘膜癌变的演进逐渐减弱,采用有序分组资料的线性趋势检验(Chi-Square and Correlations Test)分析(P<0.05)。结论：let-7a表达的减弱与胃粘膜癌变演进过程相关,let-7a在胃癌的发生过程中可能起重要作用。第二部分let-7a慢病毒载体的构建与鉴定目的：构建人let-7a基因慢病毒载体,用于后续试验。方法：扩增出let-7a基因的全长,构建Pwpxl-MOD2-let-7a真核表达载体。将四质粒将Pwpxl-MOD2-let-7a、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共转染包装细胞293 T,包装产生慢病毒。经超速离心收集病毒颗粒,转导HEK293 T细胞,以流式细胞仪鉴定的EGFP的表达,计算出慢病毒的功能滴度。结果：成功构建Pwpxl-MOD2-let-7a真核表达载体,四质粒PwpxMOD2-let-7a、pRsv-REV、pMDLg-pRRE和pMD2G共转染HEK 293 T细胞后包装产生病毒。结论：构建成let-7a表达载体Pwpxl-MOD2-let-7a;成功包装出人let-7a基因慢病毒载体,并包装出高滴度病毒：为通过let-7a治疗恶性肿瘤的研究奠定了基础。第三部分let-7a对胃癌细胞SGC-7901生物学行为影响的体外实验目的：筛选稳定过表达let-7a的胃癌细胞,观察let-7a在体外实验中在对胃癌细胞的影响。方法：将let-7a用重组慢病毒转导入人胃癌SGC-7901细胞,Real-Time RT-PCR的方法测定目的基因分子拷贝数。通过细胞增殖、黏附、侵袭试验及细胞周期的检测等来观察let-7a对胃癌细胞的影响。结果：(1)let-7a能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞,转导效率几乎达100%,同时达到稳定的表达,荧光定量RT-PCR能检测到let-7a在靶细胞中的高表达；(2)在SGC-7901细胞株,转导入let-7a后的细胞的增殖明显的比亲代细胞慢(P<0.01)；(3)细胞黏附试验提示let-7a能明显抑制胃癌细胞的黏附能力；(4)细胞侵袭力试验提示let-7a能明显抑制胃癌细胞的侵袭能力；(5)用流式细胞仪对细胞周期分析显示let-7a对SGC-901的细胞周期有明显的滞留作用并(P<0.01)结论：慢病毒载体作为转基因的工具,能高效转导和稳定表达let-7a；let-7a能够抑制SGC-7901细胞的增殖、黏附、侵袭能力和阻滞细胞周期进展,提示let-7a能有效的抑制胃癌细胞。第四部分let-7a对裸鼠人胃癌皮下移植瘤生长的影响目的：构建裸鼠的人胃癌皮下移植瘤模型,观察let-7a裸鼠胃癌皮下瘤对生长情况影响。方法：将稳定过表达let-7a的胃癌细胞株注入裸鼠皮下,建立裸鼠人胃癌移植瘤模型,并用亲代、导入空载体的SGC-7901细胞组作对照,6周后比较三组形成的皮下移植瘤体积及重量差异。结果：成功构建裸鼠人胃癌皮下移植瘤模型：6周后取下三组裸鼠皮下移植瘤率,实验组、空载体组、亲代细胞组的平均体积分别为：1100±50mm3、1300±68mm3、1340±55mm3。平均重量分别为：1250±20mg、1330±32mg、1350±31mg。实验组与亲代细胞组的平均体积、重量存在显著差异(P<0.05),但空载体组与亲代细胞组的平均体积、重量的差异无显著性(P>0.05)。结论：过表达let-7a在体内可抑制胃癌生长,证实其在胃癌具有肿瘤基因治疗的潜力。第五部分应用蛋白组学技术分离鉴定let-7a影响胃癌SGC-7901细胞功能的相关蛋白目的：比较胃癌细胞SGC-7901、SGC-7901／EV、SGC-7901／let-7a之间差异表达的蛋白质,筛选let-7a影响SGC-7901细胞生物学行为的相关的功能蛋白,丰富let-7a对SGC-7901细胞生物学行为影响机制的理论。方法：利用固相pH梯度双向凝胶电泳技术,分离胃癌细胞SGC-7901、SGC-7901／EV、SGC-7901／let-7a的总蛋白,建立SGC-7901、SGC-7901／EV、SGC-7901／let-7a的蛋白表达谱：用Image Master 2D Elite4.01图像分析软件,比较这三种组织中蛋白的表达差异,对差异表达蛋白进行质谱分析和Swiss-prot数据库搜索。Western blot分析部分蛋白质如细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白1、Skp2蛋白和纤维连接蛋白在三株细胞系中的差异表达水平。结果：建立了胃癌细胞SGC-7901、SGC-7901／EV、SGC-7901／let-7a的蛋白表达图谱,用扫描仪扫描后经Image Master 2 D Elite 4.01软件分析发现,蛋白质点数分别为1043、1046、1026,获得的大部分蛋白质的表达模式是相同的。其中SGC-7901、SGC-7901／EV两张胶中蛋白基本相同。在SGC-7901／EV、SGC-7901/let-7a胶中,可以在预期等电点和分子量大小处找到GFP蛋白,并经质谱验证。SGC-7901／let-7a细胞和其他两组细胞相比,有较多不同,差异点79个：其中11个蛋白点仅在SGC-7901／let-7a细胞中表达,31个蛋白点在SGC-7901／let-7a细胞中表达上调,21个点在SGC-7901／let-7a细胞中表达缺失,16个点在SGC-7901／let-7a细胞中为表达下调(表达量低于其他的5倍以上)。通过筛选,选择差异比较显著的6个点仅在在SGC-7901／let-7a细胞中表达和4个SGC-7901／let-7a细胞中缺失的点打质谱分析。经质谱分析鉴定出10种差异蛋白。其中：抗氧化蛋白2、胰岛素样生长因子结合蛋白2、二硫化蛋白异构酶A2、四氢叶酸合成酶、细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白1、Rho-GTPsae激活蛋白4等6种蛋白质在SGC-7901/let-7a细胞中高表达；Skp2蛋白、血小板黏附蛋白CD41、纤维连接蛋白、Cks1蛋白等4种蛋白质在SGC-7901/let-7a细胞中低表达。通过搜索Swiss-port数据库,明确了这些蛋白的基本生物学信息,它们可能与细胞周期调控、肿瘤的侵袭转移及细胞代谢有关。通过Western blot分析,验证了SGC-7901、SGC-7901／EV、SGC-7901/let-7a三组细胞中的细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白1、Skp2蛋白和纤维连接蛋白表达水平差异。结论：胃癌细胞SGC-7901、SGC-7901／EV、SGC-7901／let-7a之间存在多种差异表达的蛋白,这些蛋白可能通过影响细胞周期调控、肿瘤的侵袭与转移及细胞代谢等,与SGC-7901细胞的生物学行为密切相关。对这些蛋白的研究探讨有助于丰富let-7a对SGC-7901细胞生物学行为影响机制的理论。