【摘 要】
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目的肾脏肥大和细胞外基质蛋白的积累是糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）的主要表现之一。其中,肾小球系膜的损伤是糖尿病肾病发展的核心。本课题组前期的研究结果发现:在系膜细胞中过表达RCAN1.4后,细胞内线粒体ROS明显增加,并且促进细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）蛋白累积。我们推测在糖尿病肾病中,RCAN1.4诱导线粒体受损并参与系膜细胞细胞
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目的肾脏肥大和细胞外基质蛋白的积累是糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）的主要表现之一。其中,肾小球系膜的损伤是糖尿病肾病发展的核心。本课题组前期的研究结果发现:在系膜细胞中过表达RCAN1.4后,细胞内线粒体ROS明显增加,并且促进细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）蛋白累积。我们推测在糖尿病肾病中,RCAN1.4诱导线粒体受损并参与系膜细胞细胞外基质蛋白的上调。因此,本课题探究RCAN1.4在系膜细胞中对线粒体动力学和功能的影响;利用线粒体分裂抑制剂Mdivi1和靶向线粒体的抗氧化剂Mito TEMPO探究RCAN1.4是否通过调控线粒体动力学来介导细胞外基质蛋白上调,以期揭示糖尿病肾病的发病机制,为糖尿病肾病的治疗提供新的靶点。方法1.高浓度葡萄糖处理系膜细胞,观察RCAN1.4蛋白的上调是否早于Drp1转位:采用30mmol/L的高浓度葡萄糖（high glucose,HG）处理系膜细胞1h、3h、6h,Western blot检测系膜细胞中RCAN1.4、Drp1蛋白的含量以及是否转位至线粒体。2.观察RCAN1.4过表达对系膜细胞线粒体动力学及功能的影响:质粒转染在系膜细胞中过表达RCAN1.4,Western blot分别检测各个时间点胞浆、线粒体、以及全细胞中Drp1、Mfn2等蛋白的含量以及转位情况。Mitotracker荧光染色,共聚焦检测线粒体形态的变化;试剂盒检测ATP含量变化。流式细胞仪检测线粒体ROS含量及膜电位的变化。3.观察下调RCAN1.4对HG诱导的系膜细胞线粒体动力学及功能的影响:RNA干扰技术下调RCAN1.4后,再加HG共同处理细胞,Western blot检测RCAN1.4、FN、Drp1、Mfn2等的蛋白水平。Mitotracker荧光染色,共聚焦检测线粒体形态的变化。试剂盒检测ATP含量变化,流式细胞仪检测膜电位的变化。4.观察RCAN1.4过表达诱导的线粒体动力学改变是否介导了细胞外基质蛋白的上调:采用Mdivi 1或Mito TEMPO预处理系膜细胞后,p LHCX质粒转染过表达RCAN1.4,检测细胞外基质蛋白FN的表达水平。Mitotracker荧光染色,共聚焦检测线粒体形态的变化。试剂盒检测ATP含量变化及膜电位的变化。5.过表达RCAN1.4或下调RCAN1.4,观察系膜细胞线粒体自噬情况:质粒转染在系膜细胞过表达RCAN1.4及用RNA干扰技术下调RCAN1.4后,Western blot观察对自噬相关蛋白LC3、p62、PINK1、Parkin等表达的影响。结果1.30mmol/L的HG处理可诱导系膜细胞胞浆中的Drp1向线粒体转位,虽然RCAN1并未转位至线粒体,但是高糖诱导的RCAN1.4蛋白水平的上调早于Drp1向线粒体的转位,提示RCAN1.4上调是Drp1转位的上游事件,推测RCAN1.4可能调控系膜细胞线粒体的动力学变化。2.质粒转染在系膜细胞过表达RCAN1.4后,线粒体分裂相关蛋白Drp1蛋白表达明显升高且Drp1向线粒体转位增加,线粒体融合相关蛋白Mfn2蛋白水平明显降低。线粒体形态出现片段化,长条形线粒体减少,说明线粒体分裂增加,融合减少。细胞内ROS水平明显升高、ATP降低、线粒体膜电位降低,说明RCAN1.4能够诱导系膜细胞线粒体动力学的改变并导致线粒体损伤。3.RNA干扰技术下调RCAN1.4后,再加HG共同处理细胞,发现下调RCAN1.4能明显抑制HG诱导的Drp1蛋白水平的增加,抑制HG诱导的Mfn2蛋白水平的降低,同时改善HG诱导的线粒体的破碎化、细胞内ATP含量的减少、线粒体膜电位的降低。说明敲减RCAN1.4能够抑制系膜细胞线粒体的分裂且缓解HG诱导的线粒体损伤。4.线粒体分裂抑制剂Mdivi1及靶向线粒体的抗氧化剂mito TEMPO抑制了RCAN1.4诱导的系膜细胞线粒体的破碎化及线粒体的损伤,抑制了RCAN1.4过表达诱导的细胞外基质蛋白FN的上调。5.质粒转染在系膜细胞过表达RCAN1.4后,自噬相关蛋白LC3、p62和线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin等蛋白表达量增加。RNA干扰技术下调RCAN1.4后,再加HG共同处理细胞,发现下调RCAN1.4能明显抑制HG诱导的LC3、p62、PINK1、Parkin的上调。结论1.在系膜细胞中过表达RCAN1.4能诱导线粒体动力学的改变,使线粒体分裂增加,从而导致线粒体膜电位降低、ATP生成减少。2.过表达RCAN1.4激活了PINK1/Parkin依赖的线粒体自噬途径,但是可能由于自噬流通路不畅导致p62累积。3.RCAN1.4诱导的线粒体过度分裂参与了胞外基质蛋白FN的表达上调。
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