牦牛Fas和FasL基因克隆,生物信息学分析及其在主要组织器官中的表达

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【目的】Fas/FasL系统介导的细胞凋亡存在于哺乳动物的多种组织中,参与外周自身反应性T细胞克隆的删除,抗原诱导活化的T细胞的凋亡,细胞毒性T细胞的细胞毒作用,免疫赦免现象及肿瘤的免疫逃逸机制,雌性动物生殖器官的周期性重塑等,具有重要的生理功能,为了进一步理解Fas/FasL系统,本研究拟克隆牦牛Fas和FasL基因,并进行相关的生物信息学分析,且对两个基因在牦牛各组织器官中的表达进行研究。【方法】基于黄牛的Fas和FasL基因的cDNA序列设计引物,通过RT-PCR方法克隆牦牛的Fas和FasL基因序列,通过相关软件及网络资源对目的基因进行生物信息学分析,并结合RT-PCR方法和免疫组化方法,对Fas和FasL基因在牦牛各组织器官中的表达进行检测。【结果】克隆得到了2605bp的牦牛Fas基因cDNA序列,包含完整的开放阅读框序列,编码一段长323个氨基酸残基的蛋白质序列;推导的蛋白质序列在氨基端有一段长22个氨基酸残基的信号肽序列,中间有一段20个氨基酸的跨膜区,将整个蛋白分成胞外区和胞质区,胞外区主要由无规卷曲与延伸链组成,胞内区最后约100个氨基酸残基形成α-螺旋区域。克隆得到了1572bp的牦牛FasL基因序列,包含114bp的5’非翻译区,831bp的编码区和627bp的3’非翻译区;牦牛FasL基因的编码区编码277个氨基酸,羧基端179个氨基酸残基在胞外,氨基端75个氨基酸残基在胞内,跨膜区含23个氨基酸残基,无信号肽序列。同源性分析发现两个基因与其它物种的相应序列有很高的同源性。RT-PCR分析显示除了在心脏中只检测到Fas mRNA外,Fas和FasL mRNA共同表达于所有检测的组织中,且两个基因均在肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结、胸腺、睾丸和胎盘突中强表达。免疫组化检测发现FasL蛋白在多种细胞的胞质中表达。【结论】Fas和FasL在进化中较为保守。Fas和FasL共同表达于牦牛的各种器官,且两个基因相关表达,即Fas在某一器官中强表达时,FasL的也强表,反之亦然。FasL蛋白在牦牛的肝脏和肾脏中都强表达,而这两个器官既非淋巴性也非免疫赦免位点,提示Fas/FasL系统还有更为复杂的功能。FasL蛋白存在于牦牛多种细胞的胞质中,该形式的Fasl的功能及作用机理需进一步研究。
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