【摘 要】
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近年来,随着国民生活水平的提高,消费者对羊肉产品的需求量也随之增加,但我国肉羊单产水平低,尤其是山羊的出栏胴体重和屠宰率明显低于波尔山羊等优良品种,严重限制了我国肉用山羊养殖业的发展。而提高山羊产肉量势必要关注山羊肌肉生长发育,因此探索山羊肌肉发育的分子调控机制迫在眉睫。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）作为生物体内重要的转录调控因子,已有大量研究表明其可参与
【基金项目】
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国家重点研发计划项目“山羊高效安全养殖技术应用与示范”（No.2018YFD0502000）； 国家科技支撑计划课题“肉羊特色种质资源群体选育与创新利用”（No.2015BAD03B05）；
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近年来,随着国民生活水平的提高,消费者对羊肉产品的需求量也随之增加,但我国肉羊单产水平低,尤其是山羊的出栏胴体重和屠宰率明显低于波尔山羊等优良品种,严重限制了我国肉用山羊养殖业的发展。而提高山羊产肉量势必要关注山羊肌肉生长发育,因此探索山羊肌肉发育的分子调控机制迫在眉睫。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）作为生物体内重要的转录调控因子,已有大量研究表明其可参与细胞增殖分化、个体发育、蛋白质修饰以及疾病发生等多种生物途径,且有研究表明lncRNA可通过作用于骨骼肌卫星细胞（Skeletal muscle satellite cells,SMSCs）来调控动物肌肉的生长发育。本研究利用RNA-Seq技术对大足黑山羊胚胎期75d和出生后1d这两个关键时期的背最长肌组织进行lncRNA比较分析,筛选在山羊不同发育阶段骨骼肌组织中差异表达的lncRNAs和m RNAs,并对其功能进行注释,进一步筛选与肌肉发育相关的lncRNAs和m RNAs,为大足黑山羊肌肉生长发育的分子调控机制研究提供科学依据。本研究主要结果如下:1.RNA测序数据:本研究从12个背最长肌组织样本的c DNA测序文库中获得的raw reads数量分布为73,036,538～159,613,839。经质控后保留下来的clean reads数量分布为72,804,930～159,280,432,与山羊参考基因组ARS1的比对率高达91.62%～94.37%,其中88.06%～91.31%的clean reads具有唯一的基因组位置,且每个样本符合Q20的reads比列在97.56%～98.57%,证明数据测序效果良好。2.LncRNA和m RNA组间差异分析:本研究共鉴定出5,699个lncRNA转录本,包括4,479个已知lncRNAs和1,220个未知lncRNAs。组间差异分析以出生后1d背最长肌组织为对照组,共鉴定出648个组间显著差异表达lncRNAs（DElncRNA,P＜0.05）,其中375个上调,273个下调;共鉴定出4,517个组间显著差异表达m RNAs（DEm RNA,P＜0.05）,其中3,140个上调,1,377个下调。3.DElncRNA靶基因预测:本研究在648个DElncRNAs靶向关系预测中,共鉴定出4,784个与lncRNA显著相关靶基因。对其进行GO和KEGG富集分析,发现大量靶基因显著富集到855个GO条目（P＜0.05）和47个KEGG通路中（P＜0.05）,其中包括大量与肌肉发育相关的GO条目和KEGG通路,表明lncRNA可以参与到肌肉发育的生物学过程中。4.利用q PCR验证RNA-Seq结果准确率:本研究随机选取10个DElncRNAs和20个DEm RNAs进行q PCR验证。结果显示lncRNA和m RNA的表达量变化趋势与RNA-Seq结果一致,一致率为90%,表明RNA-Seq结果具有高可信度。5.山羊SMSC鉴定:分离纯化原代SMSC并进行免疫荧光鉴定,结果显示Pax7基因标记和DAPI染色效果良好。在山羊SMSC分化过程中,可观察到SMSC的形态变化,能形成肌管,且SMSC的两个分化标志基因（Myo G和My HC）均稳定表达,表明山羊SMSC状态良好,稳定的大足黑山羊骨骼肌卫星细胞培养体系已被建立。6.LncRNA＿3390.1调控SMSC分化:本研究通过构建lncRNA MSTRG.3390.1（简称lncRNA＿3390.1）慢病毒过表达载体对山羊SMSCs进行转染,结果显示细胞分化标志基因Myo G和My HC的表达量均显著上调（P＜0.05）,表明过表达lncRNA＿3390.1能促进大足黑山羊骨骼肌卫星细胞分化。综上所述,本研究筛选了大量与肌肉发育相关lncRNAs和m RNAs,明确了关键候选lncRNA＿3390.1具有调控大足黑山羊骨骼肌卫星细胞分化的作用。本研究结果不仅为今后探索山羊肌肉生长发育的分子遗传机制提供了新的理解,同时为大足黑山羊分子遗传育种提供了数据参考。
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