研究背景和研究目的结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,在我国排名第四。肿瘤休眠是恶性肿瘤难以根治、发生远处转移并最终导致患者死亡的主要原因。近年来,随着医学科学技术的发展,肿瘤细胞免疫治疗越来越受到人们的关注。髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs),一类来源于骨髓且具有免疫抑制功能的细胞群体,在肿瘤的发生发展中扮演着重要的作用。在结直肠癌中,MDSCs在血液中的数量与结直肠癌患者的生存预后、临床分期有关,但它在结直肠癌肝转移休眠细胞中的作用及机制尚不清楚。因此本课题拟探讨MDSCs在结直肠癌肝转移细胞休眠活化中的作用及其机制,为临床干预肿瘤转移提供新的潜在免疫治疗靶点及联合用药策略。研究方法流式细胞技术用来检测分析人或者小鼠血液、组织中MDSCs及结直肠癌细胞的数量及所占比例;磁珠分选及流式细胞仪分选技术用来分离出人或者小鼠血液、组织中的MDSCs和结直肠癌细胞;免疫组织化学及免疫荧光用来检测组织标本中MDSCs、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关成纤维细胞的数量及各基因的表达情况;Real-time实时PCR(Q-PCR)、免疫印迹(Western blotting)用来检测基因的mRAN和蛋白水平;脾被膜注射实验用来构建结直肠癌肝转移模型。ELISA实验用来检测培养上清中细胞因子的含量。研究结果我们发现结直肠癌肝转移患者血液中MDSCs的数量明显高于不伴肝转移患者,且具有统计学差异(p<0.001)。在临床组织标本中结直肠癌肝转移灶中MDSCs的数量高于结直肠癌原发灶及正常黏膜组织中的数量(p<0.01)。在结直肠癌肝转移休眠模型中,我们发现SW620细胞在第4天左右在小鼠肝脏内能形成转移克隆灶,在第10天左右能形成肉眼可见的转移灶,而HT29细胞经脾被膜种植后则出现了一段细胞生长较为缓慢的时期(0～14天左右)。我们同时还检测了不同阶段的结直肠癌肝转移细胞与干性、增殖、周期相关标志物的表达。我们发现肿瘤细胞在生长缓慢期CD133、Vimentin表达较高,Ki-67、c-MYC表达量较低。在肿瘤细胞快速生长期,CD133、Vimentin表达较低,Ki-67/c-MYC表达量较高。在小鼠结直肠癌肝转移休眠模型中MDSCs的数量随着时间的推移而呈上升的趋势,在第18天左右趋于平缓期。MDSCs细胞与CK+CD133+细胞共同培养后,CK+CD133+细胞的干性特征降低,增殖相关基因表达增强,这说明MDSCs能促使肿瘤细胞由休眠状态转变为激活状态。我们利用流式细胞分选技术将正常人、伴或者不伴肝转移的结直肠癌患者血液中的MDSCs分离后进行基因芯片的分析,结合基因芯片结果及查阅相关文献,筛选出11个候选基因:MMP14、CXCL4、CXCL5、DLL4、CCL4、CCL7、MMP1、VEGF、CXCL1、G-CSF、CCRL2。利用Elisa实验、Q-PCR和Western blot检测并结合文献报道筛选出CCL7作为研究对象。进一步发现MDSC分泌的CCL7能够通过与结直肠癌休眠细胞膜上的CCR2相结合后使STAT3发生磷酸化,p-STAT3进入核内启动其下游基因c-MYC及Cyclin D1的转录,从而使休眠细胞活化。结论在本课题中,我们成功构建了结直肠癌肝转移休眠模型,并通过一系列的实验研究发现MDSCs与结直肠癌肝转移细胞的休眠激活和克隆增殖有关。另外,我们还对MDSCs在结直肠癌细胞休眠活化中的机制进行了初步探讨,发现MDSCs通过分泌细胞因子CCL7激活STAT3信号通路促进其下游基因c-MYC及Cyclin D1的表达升高,从而使结直肠癌肝转移休眠细胞活化。以上研究揭示了 MDSCs在结直肠癌转移休眠中的作用及机制,为临床干预肿瘤转移提供新的潜在免疫治疗靶点及联合用药策略。创新性1.本研究揭示并证实了 MDSCs能促进结直肠癌肝转移细胞的休眠活化的作用,并初步阐明了 MDSCs调控转移细胞休眠活化的机制。2.为临床干预结直肠癌转移细胞休眠活化提供新的应用靶点和治疗策略。