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第一部分Tim-3及其配体Galectin-9在大鼠肺移植术后急性排斥反应期的表达及意义实验背景：肺移植是目前治疗终末期肺病唯一有效的方法。尽管手术技术及免疫抑制剂在不断改进,然而临床上较之其他实体器官移植预后仍较差,急性排斥反应的发生是影响其预后的一个危险因素。因此对AR进行早期监测诊断并进行有效治疗,对于改善肺移植患者的预后至关重要。近年来大量文献证实Tim-3及其配体Galectin-9在人类肾移植术后排斥反应期显著性升高,并推断其可作为肾移植术后排斥反应发生的预测因子。实验目的：通过检测Tim-3及其配体Galectin-9在大鼠肺移植术后AR期移植物中的表达,探讨其对肺移植术后AR发生的影响及意义。实验方法：借助大鼠左肺原位移植模型作为研究对象,受体大鼠未给予任何免疫抑制剂,分别设立同基因组(Lewis-Lewis)和同种组(Fisher344-Lewis),移植物分别在肺移植术后第3、7以及10天,组织病理学评估急性排斥反应的级别；免疫组织化学检测移植物内浸润的T淋巴细胞；应用免疫荧光双标法检测Tim-3在T淋巴细胞上的表达；实时定量PCR检测移植物内Tim-3、Galectin-9及相关炎症因子mRNA的表达并进行相关分析。实验结果：肺移植术后,在上述不同时间点同基因组移植肺接近于正常肺组织,无排斥现象发生或排斥级别较低；而与同基因组不同,同种组移植肺在AR期随时间的变化其排斥程度逐渐加重。通过免疫学检测发现CD4/CD8比值的下降与AR发生的严重程度相关；与同基因组相比,Tim-3及Galectin9在AR期同种组移植肺内的表达显著性升高(P<0.05),而且Tim-3在CD4+和CD8+T淋巴细胞上的表达也显著性升高(P<0.05)。在mRNA水平,Tim-3、Galectin-9及炎症因子IFN-γ、IL-17在AR期同种组移植肺内的表达也显著性上升(P<0.05),其中Tim-3的表达与IFN-y及IL-17呈正相关,并且与Galectin-9的表达有一定的相关性；而Galectin-9的表达水平与IFN-y的表达及AR发生的严重程度也存在一定的关联性。实验结论：本研究首次表明Tim-3及其配体Galectin-9在同种异体移植肺内急性排斥反应期显著性升高,在大鼠肺移植术后急性排斥反应的发病机制中起着重要作用,并可作为肺移植术后检测急性排斥反应发生的一种新的预测因子。第二部分重组人Galectin-9蛋白的体外合成及其对肺移植术后T淋巴细胞的作用检测实验背景：半乳糖凝集素-9(Galectin-9)是一种糖结合蛋白,属于半乳糖凝集素家族(Galectin family)成员,组织分布广泛,在介导细胞分化、凋亡、粘附、细胞间聚集、炎症反应的调控和肿瘤转移等方面发挥着重要作用。近年来国内外学者通过体外合成Galectin-9蛋白并进行相关的实验研究,对其生物学特性有了更深一步的了解。实验目的：本研究旨在通过全基因合成法体外合成重组人Galectin-9蛋白,并检测其对肺移植术后的T淋巴细胞作用,为进一步研究其生物学功能奠定基础。实验方法：本实验利用密码子优化软件优化人Galectin-9基因,采用全基因合成法合成优化后的人Galectin-9基因片段,利用基因工程技术构建重组表达质粒pET28a-Galectin-9,然后进行DNA序列分析鉴定,并将重组表达质粒转染感受态的大肠杆菌BL21(DE3),构建蛋白表达载体,诱导表达、纯化、鉴定人重组Galectin-9蛋白抗原活性。取同种异体左肺原位移植术后3天的小鼠(BALB/c-C57BL/6)脾脏细胞,分离出T淋巴细胞,并加入不同浓度的人重组Galectin-9蛋白体外培养72小时,采用MTT法检测T淋巴细胞的增殖,ELISA法检测细胞上清中炎症因子的水平。实验结果：全基因合成了人Galectin-9基因序列,成功构建重组表达质粒pET28a-Galectin-9,经酶切鉴定和DNA/序列测序分析正确,将重组表达质粒转染表达宿主,诱导表达产物并纯化,经SDS-PAGE和Western Blot分析,表明表达蛋白为重组人Galectin-9蛋白并具有抗原活性。重组人Galectin-9蛋白体外对T淋巴细胞的增殖有明显地抑制作用,这种抑制作用呈浓度依赖性,并能显著减少T淋巴细胞分泌炎症因子IFN-γ及IL-17(P<0.05),而对IL-4的分泌影响不明显(P>0.05)。实验结论：本实验成功构建含有人Galectin-9序列的原核表达载体pET28a-Galectin-9,经诱导表达及纯化,获得了纯度≥90%的重组人Galectin-9蛋白,并发现其体外能显著抑制抗原致敏后的T淋巴细胞的增殖及减少炎症因子的释放,为进一步研究进行相关的体内实验奠定了基础。第三部分激活Tim-3/Galectin-9通路能显著减轻小鼠同种异体肺移植术后的急性排斥反应实验背景：目前已知的研究表明Tim-3优先表达于Thl和Th17细胞表面,在自身免疫性疾病和同种免疫性疾病中均发挥着重要作用。Galectin-9是目前确定的Tim-3的配体且由此而建立的Tim-3/Galectin-9通路在调节Thl及Th17免疫反应中起着重要的作用。近年来,国内外研究者通过给予重组Galectin-9蛋白激活Tim-3/Galectin-9通路,在自身免疫性疾病和同种免疫性疾病的动物模型中,均起到了良好的保护作用,但是否对肺移植术后移植物有类似的保护作用目前尚未有报道。实验目的：观察给予重组人Galectin-9蛋白对同种异体小鼠肺移植术后急性排斥反应的影响,探讨外源性Galectin-9激活Tim-3/Galectin-9通路在小鼠肺移植模型中的免疫调节作用。实验方法：建立小鼠同种异体左肺原位移植模型(BALB/c-C57BL/6),分别建立实验组和对照组。实验组受者术后连续7天给予重组人Galectin-9蛋白,对照组则给予PBS。术后第7天分别获取实验组和对照组的移植肺,病理切片观察排斥反应情况,免疫组化观察移植物内浸润的CD4+和CD8+T细胞数量及Tim-3+细胞数量。实时定量PCR检测移植物内的相关因子的mRNA表达。TUNNEL法检测移植肺内的凋亡细胞数。实验结果：与对照组相比,病理学检测显示重组人Galectin-9蛋白治疗组移植肺的排斥反应明显减轻(P<0.05)；免疫组织化学结果显示浸润的CD4+和CD8+T细胞数及Tim-3+细胞数均明显减少(P<0.05)；给予重组人Galectin-9蛋白后移植物内的Tim-3、 IFN-y及IL-17mRNA的表达明显减少(P<0.05),而Foxp3及Galectin-9mRNA表达显著升高(P<0.05)；同时凋亡检测显示实验组凋亡细胞数明显增多(P<0.05)。实验结论：通过给予重组人Galectin-9蛋白激活Tim-3/Galectin-9通路可显著减轻小鼠同种异体肺移植术后急性排斥反应,其机制是降低移植肺内T淋巴细胞的浸润,并诱导Tim-3+T细胞的凋亡,减少炎症因子的释放等下调Thl和Th17细胞的免疫反应,为进一步研究肺移植术后的抗排斥反应提供了新的思路。