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胰腺癌是常见的恶性肿瘤之一,发病率占人类全身肿瘤的1%-3%,消化道肿瘤的8%～10%。其恶性程度高,难于早期诊断。目前外科手术是根治胰腺癌的唯一方法,但在胰腺癌患者中,仅约20%可行手术治疗,而接受根治性手术患者的5年生存率仅20%-25%,80%无法手术或有远处转移的胰腺癌患者2年生存率为5%～18%,5年生存率为0-5%。因此,辅助治疗尤其是化学治疗(化疗)对于改善进展期胰腺癌患者的生活质量极为重要.同时在一定条件下可延长生存期,并可能赢得手术机会。冬凌草甲素(oridonin)是从唇形科(Labtea)香茶菜属(Rabdosia)植物中分离出的一种贝壳杉烯二萜类(ent-kaurene diterpenoid)天然有机化合物。研究发现,冬凌草甲素具有较强的抗肿瘤活性,对多种肿瘤细胞具有抑制增殖和促凋亡作用。但由于其水溶性差,吸收率低,体内生物半衰期短,目前有关制剂的临床抗癌疗效尚不理想。因此如何增加冬凌草甲素的水溶性、提高其生物利用度是亟待解决的问题。纳米混悬剂是适用于难溶性药物的新剂型,系将药物颗粒粉碎到纳米级后悬浮于分散介质中。其优点是增加了药物的溶解性并最终提高了药物的释放速率。与传统意义上的基质骨架型纳米体系不同,纳米混悬剂无需载体材料,有效避免了共溶剂的毒副作用以及环糊精对药物分子大小的要求。纳米混悬剂还能产生生物粘附性,增加药物稳定性从而提高药效。本课题研究了冬凌草甲素原料药及其纳米混悬剂对人胰腺癌细胞PANC-1增殖和凋亡的影响及其作用机制,进一步分析比较冬凌草甲素原料药及其纳米混悬剂作用效果的差异,以评价冬凌草甲素抗胰腺癌的效果以及冬凌草甲素纳米混悬剂的应用价值。研究结果为临床药物剂型的开发应用提供了实验依据,同时对促进中药现代化的发展也具有重要意义。第一部分冬凌草甲素及其纳米混悬剂对PANC-1细胞生长的抑制作用[研究目的]检测并比较冬凌草甲素及其纳米混悬剂对PANC-1细胞增殖的抑制作用[研究方法](1)光学显微镜观察不同浓度冬凌草甲素及其纳米混悬剂对PANC-1细胞生长的影响。(2)MTT试验检测冬凌草甲素及其纳米混悬剂对PANC-1细胞存活率的影响。[结果](1)光学显微镜观察可见,细胞在形态上的变化,细胞变圆皱缩,并且随着冬凌草甲素浓度的增加,细胞数量逐渐减少。(2)MTT实验结果显示,细胞生长抑制率都随给药浓度的增加和用药时间的延长逐渐升高,呈明显的剂量和时间依赖性。在相同用药浓度下,冬凌草甲素纳米混悬剂对PANC-1细胞的生长抑制作用效果更好。[结论]冬凌草甲素及其纳米混悬剂对PANC-1细胞生长均有抑制作用,并且其混悬剂的抑制效果更明显。第二部分冬凌草甲素及其纳米混悬剂对PANC-1细胞凋亡的影晌[研究目的]检测比较冬凌草甲素及其纳米混悬剂对PANC-1细胞凋亡的影响,探讨凋亡机制。[研究方法](1)碘化丙啶(PI)染色和Hoechst 33342染色法观察不同浓度冬凌草甲素及其纳米混悬剂作用于PANC-1细胞后,细胞的形态学变化。(2)膜联蛋白V(AnnexinⅤ)/PI双标流式细胞术测定不同浓度冬凌草甲素及其纳米混悬剂对PANC-1细胞凋亡的影响。(3)分光光度法检测冬凌草甲素及其纳米混悬剂分别作用于PANC-1细胞不同时间后,Caspase-3酶活性的变化。(4)Western blot法测定Caspase-3酶原(pro-caspase-3)、Bax和Bcl-2蛋白的表达变化。[结果](1)PI染色和Hoechst 33342染色结果显示,冬凌草甲素及其纳米混悬剂均能诱导PANC-1细胞凋亡。(2)冬凌草甲素及其纳米混悬剂对PANC-1细胞有明显的诱导凋亡作用,细胞凋亡率随药物浓度的增加而逐渐增加,冬凌草甲素纳米混悬剂组的凋亡率更高。(3)Caspase-3酶活性检测显示,冬凌草甲素及其纳米混悬剂作用于细胞后Caspase-3活性较对照组显著增强。(4)Western blot结果显示Caspase-3酶原被激活,Bax的表达增加,Bcl-2的表达无明显变化。[结论]冬凌草甲素及其纳米混悬剂均能诱导PANC-1细胞发生凋亡,并且纳米混悬剂具有更好的诱导凋亡作用。其机制可能是通过改变Bax／Bcl-2的表达,继而启动caspase途径诱导PANC-1细胞发生凋亡。第三部分冬凌草甲素及其纳米混悬剂对PANC-1细胞周期的影晌[研究目的]检测比较冬凌草甲素及其纳米混悬剂对PANC-1细胞周期分布的影响,探讨其影响细胞周期分布的机制。[研究方法](1)PI染色流式细胞术检测不同浓度冬凌草甲素及其纳米混悬剂对PANC-1细胞周期分布的影响。(2) Western Blot检测细胞周期相关蛋白CyclinB1、Cdc2和p-cdc2 (T161)的表达变化。[结果](1)冬凌草甲素及其纳米混悬剂均可将PANC-1细胞周期阻滞在G2／M期,且纳米混悬剂的阻滞作用更强。(2) CyclinBl和p-cdc2(T161)的表达随药物作用时间的延长而减少,Cdc2的表达无明显变化。[结论]冬凌草甲素及其纳米混悬剂均能够抑制CyclinB1和p-cdc2(T161)的表达,使PANC-1细胞周期阻滞在G2／M期。上述三部分研究结果显示,冬凌草甲素及其纳米混悬剂均可通过G2／M细胞周期阻滞和诱导凋亡抑制胰腺癌细胞PANC-1的生长,且纳米混悬剂的作用更明显。其促凋亡作用分子机制可能是通过改变Bax/Bcl-2的表达比率,激活Caspase-3,从而促进PANC-1细胞发生凋亡；G2／M细胞周期阻滞可能是通过降低CyclinB1和p-cdc2(T161)的表达而发挥作用的。