背景乳腺癌是世界上女性最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康。随着诊疗技术的不断进步,使更精准的癌症诊断以及更有效的癌症治疗成为了可能。然而,仍有许多患者最终对治疗产生了耐药性,在治疗后数年出现复发和转移,极大影响了患者的生存预后。乳腺癌作为一类具有明显异质性的恶性肿瘤,目前基于不同的基因表达谱,可以将乳腺癌分为不同的分子亚型。当前乳腺癌的治疗以手术、全身化疗、内分泌治疗、放疗以及靶向治疗等的综合治疗为基础。上述治疗手段为数十年来乳腺癌导致的死亡率的持续下降做出了重要贡献。2015年以来,新辅助化疗(Neoadjuvant chemotherapy,NAC)已成为局部晚期乳腺癌重要的治疗选择,能够消除随着血液循环播散的肿瘤细胞(微转移),达到降级降期的目的。但是,即使完成了新辅助化疗或者接受了局部治疗后,仍有部分患者可能存在微小残留病灶,而这是远处复发转移的关键原因。临床现有的生物标志物检测如CEA、CA-153等,以及影像学检查手段,均无法早期准确评估病情。肿瘤标本的组织病理学活检虽然作为目前临床病理诊断的金标准,然而这种方法同样具有一定的局限性。循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ct DNA)检测作为一种无创的液体活检技术,已广泛应用于乳腺癌的早期筛查、诊断、治疗和预后等方面。ct DNA具有比传统蛋白质类癌症生物标志物更短的半衰期,并且能够克服传统病理活检的局限性,不受取样位置的限制,能够克服空间、时间异质性,全面反映肿瘤基因谱特征。另一方面,ct DNA能够实时监测患者对治疗的反应及预后,这有助于快速反馈既定治疗是否有效,从而可以及时调整治疗方案,真正实现个体化精准治疗。近年来,随着新型高通量测序技术的发展,液体活检方法已经能够在实体肿瘤的标准治疗过程中得到应用,表明了其并不需要提供传统意义上的组织标本而同样能够揭示癌症的全面信息。然而,ct DNA检测在评价局部晚期乳腺癌新辅助化疗疗效及预测早期复发中的价值尚不明确。目的本研究拟采用包含727基因的二代测序技术对局部晚期乳腺癌患者进行多时间节点的ct DNA检测和组织样本基因检测,旨在评估NAC前后ct DNA的突变特征,以及肿瘤组织突变特征,评估ct DNA作为预测NAC治疗反应的生物标志物的可行性。同时,我们探讨了手术后6个月的ct DNA是否可预测乳腺癌复发进展。方法1.患者入组根据以下纳入及排除标准,前瞻性地收集2018年1月至2019年1月陆军军医大学大坪医院乳腺甲状腺外科诊治的女性局部晚期乳腺癌患者。研究纳入标准:(1)女性,无化疗禁忌;(2)穿刺活检确诊为乳腺浸润性癌;(3)无其他部位恶性肿瘤病史;(4)患者新辅助化疗前临床分期为ⅡB-Ⅲ期;(5)患者行4-6个周期新辅助化疗,当出现不可耐受毒副作用或疾病进展并且医生认为不宜继续化疗的其他情况时中止治疗;(6)新辅助治疗结束后可手术患者1个月内进行手术,手术方案为乳腺癌改良根治术或保乳术,联合前哨淋巴结活检或腋窝淋巴结清扫术。研究排除标准:(1)炎性乳腺癌;(2)哺乳期乳腺癌;(3)入院前已行肿块切除;(4)不能按既定方案完成化疗、手术;(5)合并远处转移的Ⅳ期乳腺癌;(6)男性乳腺癌。完整记录临床病理资料。本研究设置了3个时间节点,分别为新辅助化疗治疗前(C1时间节点)、手术切除肿瘤组织(T时间节点)和手术后6个月(C2时间节点)。我们在C1、C2节点收集患者的外周血,T节点收集患者的肿瘤组织。对所有血液样本的ct DNA和所有组织样本的组织DNA进行基于二代测序(NGS)技术,包含727个基因的靶向序列分析。与此同时,广泛运用于临床上的癌症生物标志物包括糖类抗原15-3(CA15-3)、糖类抗原12-5(CA12-5)及癌胚抗原(CEA)在相同的3个时间点被检测。本研究经陆军军医大学大坪医院伦理委员会批准(No.2018(57))。研究方案符合美国赫尔辛基宣言的原则。本研究所有入组患者均签署知情同意书。2.样本处理C1及C2时间节点10 ml外周血样本及T时间节点组织样本分别采用相关试剂盒进行游离DNA提取。首先于4°C 1600×g离心15分钟,得上清液,然后4°C 16000×g离心15分钟。使用血浆和外周血细胞按照各自操作说明书提取游离DNA(cf DNA)和基因组DNA(g DNA)。根据标准流程提取肿瘤DNA(t DNA)。3.建库测序本研究中采用广州拓普基因公司设计的涵盖2.8 Mb区域的727基因大panel来捕获目标DNA片段。该技术对体细胞单核苷酸变异(Single nucleotide variants,SNVs)及小插入/缺失(In Dels)的检测下线为≥0.50%,拷贝数变异(Copy number variants,CNV)的检测下限为≥3拷贝。cf DNA和t DNA均采用Kapa DNA文库制备试剂盒(Illumina,San Diego,USA),g DNA则采用Illumina Tru Seq文库制备试剂盒(Illumina,San Diego,USA)进行DNA文库制备。DNA文库与727个基因探针进行杂交,然后使用DNBSEQ-2000测序仪(华大基因,深圳,中国)进行DNA测序。原始测序数据按照默认参数进行数据筛选,为后续分析保留高质量的reads。使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA-0.7.17-r1188)将过滤好的数据与人类基因组hg19进行比对,并采用Genome Analysis Toolkit(GATK 4.0.12.0)去除重复reads以及重新校准。生成的BAM文件用于后续调用分析。4.体细胞变异分析使用GATK(4.0.12.0)分析SNVs及In Dels,使用Haplotype Caller in GATK分析胚系变异。对于所有变异分析,与每个样本相匹配的g DNA均被用作对照,用来排除种系变异。从正常样本中生成一组正常数据(Panel of Normal,Po N)来改善变异分析结果。剔除在Po N、单核苷酸多态性数据库或1000基因组项目数据库中发现的不可靠的体细胞突变,得到质量较高的SNVs及In Dels。最后使用Integrative Genomics Viewer对BAM文件进行手动检查。肿瘤突变负荷(Tumor mutational burden,TMB)被定义为每Mb体细胞突变数。5.拷贝数变异分析使用Varscan2对配对样本进行拷贝数变异分析。简单来说,首先使用samtools mpileup程序对对照样本和肿瘤样本BAM文件进行mpileup,然后使用Copy Caller软件对mpileup结果进行鸟嘌呤-胞嘧啶校正。其次,采用圆形二值分割算法对不同拷贝数的区域进行分割。最后,结合候选CNVs片段得到CNVs。与体细胞变异分析一样,从正常样本中得到的CNV Po N来提高拷贝数变异分析准确性。6.统计分析采用单因素及多因素Cox回归风险分析评估临床病理特征与新辅助化疗治疗结果的相关性。在本研究中,使用Kaplan-Meier生存分析来确定C2时间点ct DNA样本与肿瘤复发的相关性。使用卡方检验来确定C1时间点血液中ct DNA水平与治疗效果相关性。以双侧检验P值<0.05作为差异具有统计学意义的标准。本次分析软件采用的是SPSS21.0软件和Graph Pad Prism 6软件。结果1.患者临床病理特征从2018年1月开始,前瞻性收集43例接受新辅助化疗治疗的局部晚期乳腺癌患者。其中,5例患者因个人原因拒绝于我院行手术及后续治疗而排除研究,7例患者新辅助化疗前(C1基线节点)血液样本未能提取合格的cf DNA而被排除在后续研究之外。最终纳入的31例乳腺癌患者,平均年龄(48.2±7.0),Luminal A型9例(29.0%),luminal B型8例(25.8%),HER2过表达7例(22.6%),TNBC 7例(22.6%)。依据病理学MP评级,术后新辅助化疗疗效评估达到p CR的共4例(12.9%),non-p CR患者共27例(87.1%)。癌症生物标志物检测结果示,C1组中发现指标异常的有3例(P5C1,P16C1和P17C1),T组指标异常的有1例(P5T1),C2组指标异常的有1例(P5C2)。2.靶向测序质量控制C1,T,C2三个时间节点样本的平均测序捕获效率分别为72.89%(64.20%-78.72%),74.98%(59.72%-80.62%)和72.80%(67.53%-81.05%);C1,T,C2三个节点样本的有效靶向测序深度分别为1010.19X(633.1X-1650.01X),1071.61X(474.41X-1624.33X)和925.15X(625.15X-1383.41X)。3.靶向捕获测序和基因突变结果C1、T、C2组分别鉴定出159,271,70个体细胞突变。31例C1样本中,有30例检测出体细胞突变(96.8%),而在25例C2样本中,有12例检测出体细胞突变(48%)。研究发现年龄<50的患者基线状态具有更高水平的ct DNA(p≤0.05),而基线时ct DNA水平与TNM分期、分子分型、BMI、淋巴结状态、癌栓等未见明显相关(p>0.05)。分别在C1,T和C2组中鉴定出10、26、10个体细胞热点突变。在组织样本中,最常见的体细胞突变基因分别是PIK3CA(48.5%)、TP53(41.9%)和KMT2C(9.7%)。而在全部87个样本中,最常发生突变的基因分别为KMT2C(20.69%)、PIK3CA(18.39%)和TP53(18.39%)。我们还在31名乳腺癌患者中鉴定出了6个胚系突变(19.4%),涉及BRCA2、C HEK2和MUTYH基因,分别是BRCA2:c.5645C>A(P1),BRCA2:c.987＿988ins A(P7),MUT YH:c.892-2A>G(P15),BRCA2:c.31del(P17),CHEK2:c.1651dup(P29)和BRCA2:c.3940＿3941del(P31)。在所有的87个样本中有23个(26.44%)检测到基因拷贝数异常,其中82.61%(19/23)来自组织样本,其余4个(17.29%)来自外周血样本。4.基因突变与乳腺癌新辅助化疗疗效的相关性4.1基因突变与新辅助化疗p CR率的相关性4例(P3、P4、P8、P12)患者术后病理评估达到p CR(12.9%),non-p CR患者共有27例(77.1%)。无论是C1节点还是T节点,达到p CR的患者基因突变数目与nonp CR患者基因突变数目之间均无统计学差异,故新辅助化疗前ct DNA及新辅助化疗后组织样本肿瘤突变数目与新辅助化疗p CR率无相关性。进一步分析组织和血液中最常见的三个突变基因PIK3CA、TP53、KMT2C与新辅助化疗p CR的相关性,均未发现显著相关性结果(p>0.05)。TMB和胚系突变与p CR之间的相关性同样未发现显著结果。4.2基因突变与新辅助化疗疗效(RECIST)的相关性我们依据实体瘤疗效评估标准(RECIST)评估新辅助化疗疗效,化疗后达到CR、PR者为有效,SD、PD为无效。新辅助化疗有效率64.5%(20/31),无效率35.5%(11/31)。无论是C1节点还是T节点,新辅助化疗后化疗有效的患者基因突变数目与新辅助化疗后化疗无效的患者基因突变数目之间均无统计学差异,故新辅助化疗前ct DNA及新辅助化疗后组织样本肿瘤突变数目与新辅助化疗疗效无相关性。进一步分析组织和血液中最常见的三个突变基因PIK3CA、TP53、KMT2C与新辅助化疗疗效(RECIST)的相关性,均未发现显著相关性结果(p>0.05)。TMB和胚系突变与新辅助化疗疗效之间的相关性同样未发现显著结果。5.乳腺癌复发进展的风险因素5.1乳腺癌复发转移的多因素分析随访至今,7例患者发生术后复发转移。单因素及多因素分析发现,NAC后淋巴结阳性(≥4)和新辅助化疗后达到SD的患者短期内会发生复发或转移(P=0.012;P=0.036),而癌栓、年龄、分子类型、BMI等临床因素与复发时间无关(P>0.05)。因此,我们认为淋巴结状态和SD可以作为乳腺癌复发的预测因子。5.2基因突变与乳腺癌复发进展的相关性生存分析(Kaplan-Meier曲线)结果表明,C2节点的ct DNA KMT2C c.5053G>T与乳腺癌术后复发转移显著相关(P=0.0014)。ct DNA突变可作为新辅助治疗后乳腺癌复发转移的潜在预测指标。5.3传统肿瘤生物标志物与乳腺癌复发进展的相关性在7名术后复发转移的患者CA 15-3,CA 12-5和CEA结果中,仅1例复发的患者(P5)上述肿瘤标志物出现异常,而其余6例患者均为正常,这表明传统的肿瘤生物标志物无法满足乳腺癌早期复发转移检测的需要。结论我们证实了基于二代测序的ct DNA检测应用于局部晚期乳腺癌中的可行性。C1、T、C2组分别鉴定出159,271,70个体细胞突变。31例C1基线样本中,有30例检测出体细胞突变(96.8%),而在25例C2样本中,有12例检测出体细胞突变(48%)。我们发现最常发生突变的基因分别为KMT2C(20.69%)、PIK3CA(18.39%)和TP53(18.39%)。KMT2C基因在乳腺癌患者中具有较高的突变率,尤其是TNBC患者。KM生存分析及多因素Cox回归分析均提示ct DNA KMT2C c.5053G>T是乳腺癌复发进展的预测因子,但ct DNA与新辅助治疗疗效无关(P>0.05)。ct DNA的连续检测是传统影像学检查评估肿瘤治疗的有效补充,有助于及时识别患者的病情进展,实现个体化精准治疗。