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溶藻弧菌是水产养殖动物弧菌病和人类食源性弧菌感染的病原菌。弧菌对环境适应能力与致病性紧密相关,相关调控基因的研究有助于加深对海水养殖溶藻弧菌病发生和流行的认识,对病害的预防和控制具有重要意义。
本论文克隆并分析了溶藻弧菌粗糙和光滑型菌落中σ因子rpoX(rpoS-like)、rpoS和小RNA分子伴侣hfq三个核心调控基因;并通过同源重组的方法,成功构建了这三个基因的突变和回补菌株,分析了它们在不同菌相中的功能。
发现rpoX基因的缺失突变不影响溶藻弧菌生长、菌相变化、鞭毛合成和对温度胁迫的反应,但是对细菌生物膜的形成、运动能力、糖质酸利用以及乙醇耐受、渗透压与氧负离子等胁迫条件的应答能力具有明显的调控作用,而且其调控方式依赖于菌相,说明rpoX主要参与调控溶藻弧菌环境适应并受菌相影响。以rpoX为靶基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR可特异、灵敏地检测溶藻弧菌。
rpoS基因缺失后,细菌生长速度、鞭毛合成、固体表面运动能力、生物膜形成等生化特征未受影响,但是在半固体表面的运动能力、对葡糖醛酰胺、乙酰乙酸等碳源的代谢发生变化,并呈现出菌相依赖性,然而两种菌相中突变菌株均降低了致病力,显示rpoS可能与毒力因子表达调控有关;蛋白印记表明RpoS蛋白在胞内随细胞生长逐渐累积,还发现一个未知蛋白与RpoS协同表达;rpoX和rpoS双突变后生物膜和运动能力发生了变化,显示这两个基因可能相互调控表达并协同参与对胁迫环境因子的应答。
hfq向基因突变株和野生株的表型及生理差异显著-突变株生长延迟、菌相转化为粗糙型、运动能力下降、生物膜形成能力减弱、对多种碳源利用能力丧失,但是突变并不改变细菌鞭毛合成;hfq突变还导致溶藻弧菌完全丧失了致病力,说明hfq是溶藻弧菌的泛调控因子,而且是致病过程中的关键调控基因。
我们推测,在溶藻弧菌中hfq是菌落相变的关键调控基因,它在影响菌相的同时直接或间接调控rpoX与rpoS基因的表达。