论文部分内容阅读
水稻条纹病毒(Rice stripetenuivirus,RSV)是白细病毒科(Phenuiviridae),纤细病毒属(Tenuivirus)代表成员,其基因组含4条单链RNA,通过负义或双义策略共编码7个蛋白。与其它分段负义RNA病毒(sNSV)一样,RSV在基因表达过程中采用“抓帽”机制,即从寄主mRNA抓取一段10-20个碱基的帽子序列,以之作为引物起始转录,合成5’端含一段异源序列的病毒mRNA。最近,本实验室利用高通量测序技术获得了 RSVNP和NCPmRNA的帽子序列,为解析RSV的“抓帽”机制提供了许多新的视角。然而,由于RSV其它mRNA相对于基因组RNA(或其互补链)的含量太低,在经过多次尝试后,我们无法获得它们的帽子序列,因而我们不能确定所得数据是否具有偏颇。尤其,我们发现RSV在合成NP和NCP mRNA时,使用“引发与重配”(prime-and-realign)机制的频率不同,但不确定RSV合成其它mRNA时是否也存在这种差异。查阅文献发现,eIF4E蛋白能结合mRNA的帽子结构。已有研究者通过基因改造,提高了 eIF4E对帽子结构的亲和性。也已有研究者利用eIF4E蛋白突变体(eIF4EK119A)富集含帽子结构的RNA。基于此,本研究尝试利用eIF4EK119A富集RSV mRNA,进而获得更完整的RSV帽子序列谱。首先,本研究将eIF4EK119A构建到带GST标签的原核表达载体pGEX-4T-3,所得重组质粒转Rosseta菌株;通过优化条件(IPTG终浓度为0.25 mMol,16 ℃、180rpm、10-13 h)获得 eIF4EK119A 蛋白;将 eIF4EK1 19A 蛋白(GST磁珠结合)与提取自RSV侵染水稻的60μg总RNA混合,以免疫共沉淀的方式获得富集的mRNA 3 μg;以富集的mRNA为底物,利用本实验室已建立的技术,先对 RSVNVS2、NSvc2、NS3、NCP 和 NSvc46 种 mRNA 的 5’端进行了传统的克隆和测序。结果表明,所得序列90%含帽子序列,这表明本研究成功以 eIF4EK119A 富集了 RSV mRNA。本研究接着以富集的RSV mRNA为材料,利用Cap-seq技术,获取了NS2、NSvc2、NS3、NP、NCP和 NSvc4 6 种 mRNA 的“帽子序列谱”,分析结果表明:(1)在合成各mRNA时,RSV的“抓帽”模式无明显差异;(2)RSV在转录病毒链时比转录互补链时更频繁地使用“引发与重配”机制,其结果是RSV病毒链的转录物比互补链的转录物具有更长和更复杂的帽子序列。本研究利用eIF4EK119A蛋白实现了 RSVmRNA的富集,并在此基础上,首次获得了一个较为完整的RSV“帽子序列谱”。以此为基础,本研究首次表明RSV在转录病毒链时比转录互补链时更频繁地使用“引发与重配”机制,这为进一步认识RSV的“抓帽”机理迈出了重要一步。