能量稳态是机体维持正常的新陈代谢所必不可少的条件,能量的摄入大于消耗就会破坏能量稳态,从而导致代谢相关疾病的发生和发展。AMP激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）是能量稳态的主要调节蛋白,能够感知能量状态,在自身磷酸化水平被改变的同时,调节多种下游靶蛋白的活性从而控制代谢进程,这种磷酸化调控网络是精细而又复杂的,但是具体调控机制尚需进一步探索。Rab蛋白是一种小G蛋白,主要定位于细胞内膜系统,负责囊泡的形成以及运输等过程,但是多项研究已经表明Rab蛋白还参与调节代谢进程,AMPK能否通过Rab蛋白调控能量代谢尚不清楚。另外,尚无研究证实,Rab蛋白是否对AMPK的磷酸化功能有所调控。本研究旨在探究AMPK是如何通过Rab蛋白发挥功能以及Rab蛋白是否对AMPK的磷酸化功能有所调控。我们首先构建了葡萄糖饥饿系统,探究AMPK作为能量代谢调节的核心是否能够感知能量不足状态从而被磷酸化激活,结果表明在HEK 293T和Hep G2两种细胞中,AMPK均能够感知葡萄糖浓度降低引发的能量不足,从而逐步被磷酸化激活,并进一步磷酸化激活下游TBC1结构域家族成员1（TBC1 domain family member 1,TBC1D1）,并且在这一过程中,我们发现,过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferators-activated receptorsγ,PPARγ）作为能量平衡的重要调节因子,其内源性和外源性的表达水平均是逐渐降低的。为了进一步验证PPARγ是否受到AMPK的调控,我们选用了AMPK抑制剂Compound C来逆转AMPK的磷酸化过程,结果表明,PPARγ在AMPK的磷酸化功能被抑制后的表达水平是逐渐升高的。因此为了探究AMPK是如何调控PPARγ的表达水平,在前期研究的基础上,我们检测了AMPK的下游靶蛋白TBC1D1是否与PPARγ存在相互作用,通过体外蛋白的纯化与结合实验,我们证明了TBC1D1与PPARγ存在相互作用,但是这种作用却不依赖于TBC1D1的磷酸化水平,这提示我们存在另外一种蛋白在AMPK磷酸化调控网络中发挥作用。鉴于TBC1D1是Rab蛋白上游的GTP酶激活蛋白（GTPases activating protein,GAP）,我们猜想Rab蛋白可能在AMPK对PPARγ的调控中发挥作用,因此我们在HEK 293T细胞中过表达PPARγ与不同浓度的Rab家族蛋白,筛选与PPARγ相互作用的Rab蛋白,并最终筛选出Rab2A可能发挥稳定PPARγ蛋白的作用,蛋白质体外结合实验进一步证明了Rab2A与PPARγ存在相互作用。为了进一步探究Rab2A稳定PPARγ的具体机制,我们在HEK 293T细胞中过表达Rab2A与PPARγ,并且选用溶酶体自噬抑制剂bafilomycin A1和泛素-蛋白酶体抑制剂MG132,结果发现Rab2A能够通过泛素-蛋白酶体途径抑制PPARγ的降解。此外,Rab蛋白具有GTP和GDP两种结构形式,为了明确Rab2A是以何种形式发挥稳定PPARγ的作用,我们构建了西方饮食模式诱导的肥胖小鼠模型和TBC1D1蛋白丝氨酸231位点失活突变的遗传学小鼠模型,通过蛋白质体外结合实验证明在AMPK的磷酸化功能被阻断后,Rab2A是以GTP的形式稳定PPARγ。以上结果提示,Rab2A在AMPK的磷酸化调控网络中通过调控PPARγ发挥作用,PPARγ作为脂代谢的调控因子,参与脂肪生成、甘油三酯合成以及脂滴的形成等过程,因此为了探究Rab2A敲降对PPARγ表达水平以及脂质代谢水平的影响,我们构建了Rab2A敲降的小鼠,并且以高脂饮食模式喂养2个月,结果发现,参与脂质代谢和胆固醇合成的蛋白表达水平被显著抑制,小鼠肝脏的脂滴也明显减少。另外,我们检测了小鼠血液中的部分代谢指标,发现Rab2A敲降导致小鼠血液中的甘油三脂、胆固醇水平降低,而胰岛素、葡萄糖和游离脂肪酸的水平未发生明显的变化,这表明Rab2A的敲降对肥胖以及非酒精性脂肪肝等疾病具有一定的缓解作用。为了进一步探究Rab家族是否在能量不足时对AMPK的磷酸化功能有所调控,我们在3T3-L1细胞中过表达不同的Rab蛋白,并通过葡萄糖饥饿实验探究AMPK磷酸化水平的改变,以此来筛选能够调控AMPK磷酸化功能的Rab蛋白。结果表明,Rab5C能够抑制AMPK的磷酸化功能。综上所述,Rab2A通过调节PPARγ的表达水平在AMPK的磷酸化调控网络中发挥作用,并且在能量充足的情况下,AMPK的磷酸化功能被阻断后,Rab2A以GTP的形式稳定PPARγ,Rab2A可能是治疗肥胖以及非酒精性脂肪肝等疾病的新靶点。此外,Rab5C能够抑制葡萄糖饥饿条件下AMPK的磷酸化功能。