弓形虫病是一种危害严重的人畜共患性寄生虫疾病,其防治方法一直是医学及兽医学研究的热点课题。桦褐孔菌多糖(IOP)作为传统中药桦褐孔菌的主要活性成分,具有广泛的药理作用。本实验室前期研究表明,IOP对弓形虫感染的小鼠体内模型及巨噬细胞体外模型均具有显著的抗弓形虫活性。为进一步完善IOP体外抗弓形虫作用及其机制,本研究选用小鼠脾淋巴细胞作为试验对象,建立弓形虫感染体外模型,观察小鼠脾淋巴细胞炎性因子和趋化因子的变化规律以及NF-κB和MAPKs信号通路关键蛋白的磷酸化水平,多层面探讨IOP对形虫感染小鼠脾淋巴细胞的免疫调控机制,为抗弓形虫药物的开发利用提供理论依据。本试验首先用小鼠脾脏淋巴细胞分离液从健康昆明小鼠中分离提取小鼠脾淋巴细胞,CCK-8法检测IOP对小鼠脾淋巴细胞的毒性并确定IOP安全给药剂量。建立弓形虫感染小鼠脾淋巴细胞体外模型,ELISA法检测细胞上清液中炎性因子IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α及IFN-γ含量。RT-PCR法检测细胞炎性因子IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ及趋化因子 MIP-1、MCP-1 mRNA 表达量。Western blot法测定TLR2、TLR4蛋白表达量,测定NF-κB信号通路关键蛋白p65、IκBα以及MAPKs信号通路关键蛋白p38、JNK、ERK1/2磷酸化水平。为进一步明确IOP作为抗弓形虫药物的作用靶点和分子机制,在IOP给药前分别使用NF-κB抑制剂BAY 11-7082、p38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125对感染弓形虫的小鼠脾淋巴细胞进行预处理,ELISA法再次观察细胞上清液中炎性因子TNF-α含量变化。CCK-8结果显示,IOP在0～100 μg/mL浓度范围内对小鼠脾淋巴细胞无明显细胞毒性作用,又经预试验确定IOP低、中、高剂量组给药浓度分别为12.5μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL。ELISA结果显示,IOP在一定程度上降低弓形虫感染小鼠脾淋巴细胞上清液中炎性因子IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α及IFN-γ含量。RT-PCR结果显示,IOP可呈剂量依赖性的抑制弓形虫感染所致小鼠脾淋巴细胞炎性因子 IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ及趋化因子 MIP-1、MCP-1 mRNA过度表达。Western-Blot结果显示,IOP能够下调弓形虫感染小鼠脾淋巴细胞TLR2、TLR4表达量,抑制NF-κB信号通路关键蛋白p65、IκBα以及MAPKs信号通路关键蛋白p38、JNK过度磷酸化。通过观察特异性抑制剂预处理染虫细胞后IOP对炎性因子TNF-α分泌的影响,结果表明NF-κB抑制剂BAY 11-7082、p38抑制剂SB203580和JNK抑制剂SP600125均不同程度的削弱了IOP对炎性细胞因子TNF-α的抑制作用。综上试验结果表明,IOP能够调控小鼠脾淋巴细胞NF-κB、p38、JNK信号通路影响炎性因子和趋化因子的分泌表达,抑制弓形虫感染所致的过度炎症反应,通过免疫调节机制发挥其抗弓形虫作用。