研究背景及目的:Ⅲ型胶原蛋白广泛应用于生物、美容、食品保健等领域,并在医药材料领域具有巨大的应用前景,国外已经开始将胶原蛋白作为支架材料用于构建器官。但限制胶原蛋白应用最大的问题是胶原蛋白的来源。目前胶原蛋白主要两大来源,一是动物来源,主要从猪、牛和鱼皮中提取。该胶原蛋白存在免疫原性与病原体污染的问题,多用于化妆品、食品领域。而医用胶原蛋白多为重组蛋白,即通过微生物发酵获得。该方法的难点在于如何提高胶原蛋白产量和形成有活性的三螺旋结构。本研究致力于克服这两个困难。胶原蛋白是由三条α链组成三螺旋结构,是一种高度羟基化蛋白。若要形成有活性的三螺旋结构,α链上的脯氨酸必须进行羟基化。羟基化反应发生在内质网和高尔基体中,由4-脯氨酸羟基化酶催化实现。人们利用CHO、HEK293等真核细胞表达胶原蛋白,但其成本高、产量低,限制了大规模生产。毕赤酵母菌是一种一般被认为安全（GRAS）的真核细胞微生物,它营养要求简单、细胞增殖快、表达量高,适合大规模表达。但毕赤酵母细胞不表达4-脯氨酸羟基化酶,故在进行人Ⅲ型胶原蛋白表达前,需将4-脯氨酸羟基化酶两个亚基的编码基因导入细胞中。研究创新性的利用自剪切2A肽,实现4-脯氨酸羟基化酶两个亚基的平衡表达。获得人Ⅲ型胶原蛋白表达菌种。研究方法:本研究选择毕赤酵母表达系统探索人Ⅲ型胶原蛋白的表达。具体方法如下:1、因尚无商业化Arg4基因互补型毕赤酵母菌表达载体,实验利用分子克隆技术,自主构建Arg4基因互补型毕赤酵母菌表达载体p ARG4。2、根据Gen Bank上查询到的编码人源Ⅲ型胶原蛋白α链基因序列（COL3A1）,与人体内编码4-脯氨酸羟基化酶两种亚基的基因序列（P4Hα和P4Hβ）,经过密码子优化以适用于酵母菌表达,优化的基因序列进行基因合成。将目的基因分别克隆到将p ARG4、p PIC9K和p PICZαA表达载体中。利用重叠PCR以及DNA无缝连接（Gibson assembly）技术,在P4Hα和P4Hβ基因中间插入自剪切2A肽序列,并克隆到表达载体p PIC9K上。3、将pARG4/P4Hα和pPIC9K/P4Hβ线性化后,电穿孔转化分别导入GS200,记为GS200/P4Hα+β;把p PIC9K/P4Hβ-2A-P4Hα线性化后,导入GS115,记为GS115/P4Hα+β。利用蛋白免疫印迹技术,检测是否成功表达α和β亚基。4、电穿孔转化,将pPICZαA/COL3A1导入工程菌中,进行甲醇诱导表达。并提取蛋白,用蛋白免疫印迹技术进行检测。研究结果:1、设计特异性引物从pBluescript SK、p PICZαA和毕赤酵母基因组DNA中获得Ampicillin抗性基因片段、5`AOX1序列片段、3`AOX1序列片段和ARG4基因片段,通过同源重组与重叠PCR技术将各片段融合在一起,构建表达载体。经基因测序鉴定,表达载体序列与设计相同,成功获得载体p ARG4。2、将优化合成的三组基因,分别克隆到表达载体上,通过PCR鉴定,酶切鉴定与基因测序,最终获得重组质粒p ARG4/P4Hα、p PIC9K/P4Hβ、p PICZαA/COL3A1和p PIC9K/P4Hβ-2A-P4Hα。3、通过PCR鉴定表明:pARG4/P4Hα和p PIC9K/P4Hβ成功导入GS200;p PIC9K/P4Hβ-2A-P4Hα成功导入GS115。将工程菌进行诱导表达,蛋白免疫印迹技术表明P4Hα和P4Hβ均成功在毕赤酵母菌中表达出α亚基和β亚基,成功获得表达4-脯氨酸羟基化酶的工程菌:GS200/P4Hα+β和GS115/P4Hα+β。4、将pPICZαA/COL3A1分别导入上述获得两种工程菌中,用zeocin筛选阳性克隆,挑取单个菌落诱导表达,蛋白免疫印迹结果表明:胶原蛋白成功在毕赤酵母中表达。研究结论:通过将P4Hα和P4Hβ基因导入酵母菌种,使酵母细胞能表达4-脯氨酸羟基化酶,该酶可对胶原蛋白进行羟基化修饰,保证重组胶原蛋白形成有活性的三螺旋结构。在此基础上,导入人Ⅲ型胶原蛋白编码基因,添加1%的甲醇进行诱导表达,最终成功获得人Ⅲ型胶原蛋白重组表达。