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目的：应用实时荧光定量逆转录多聚酶链反应(fluorogenicquantitivereversetranscriptionpolymerizechainreaction,FQ-RT-PCR)方法，检测经人巨细胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)感染和/或全反式维甲酸(all-transretinoicacid，ATRA)和/或三氧化二砷(arsenictrioxide，ATO，AS2O3)处理的人脐血造血红系祖细胞(ColonyFormingUnit-Erythroid，CFU-E；BrustFormingUnit-Erythroid，BFU-E)的HOXB6(homeoboxB6gene)基因的mRNA定量表达情况，在基因水平探讨HCMV感染导致造血红系祖细胞损害的机制。
方法：1.3例脐血标本由本院产房提供，取自正常足月顺产新生儿断脐后的胎盘段脐血。采用造血祖细胞体外培养技术，以HCMV持续感染和/或ATRA和/或AS2O3处理人脐血红系祖细胞，观察HCMV感染后和/或ATRA和/或AS2O3处理后的CFU-E，BFU-E集落形态及峰期。2.实验分组：实验分成6组①空白对照组：在正常培养体系中，不加任何的处理因素。②HCMV组：按100TCID50HCMV-AD169病毒液0.1ml感染正常的培养体系。③ATRA组：在正常培养体系中加入维甲酸，终浓度为10-6mol/l。④HCMV+ATRA组：在上述同样的人巨细胞病毒组中加入维甲酸，终浓度同上。⑤AS2O3组：在正常培养体系中加入三氧化二砷，终浓度为10-6mol/l。⑥HCMV+AS2O3组：在上述同样的人巨细胞病毒组中加入三氧化二砷，终浓度同上。3.采用原位联苯胺染色法鉴定红系祖细胞。4.不同时间点即第3天，第7天，第10天分别提取各组细胞RNA，用1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA分子的完整性。5.利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和随机引物将总RNA逆转录成cDNA，设计基因特异引物在实时荧光定量PCR仪进行体外扩增。将HOXB6基因cDNA和人磷酸甘油醛脱氢酶(gluceraldehydephosphatedehydrogenase,GAPDH)基因阳性产物cDNA梯度稀释制作各自的标准曲线，根据各个样本循环指数增长期的起始点即循环域值(cyclethreshold,Ct)和标准曲线斜率值计算各样本起始cDNA模板量倍数值，以GAPDH基因作为内参照进行标化，统计并分析各组样本的HOXB6基因表达的mRNA是否存在差异。统计方法：结果用均数加减标准差(-x±S)，进行单因素方差分析，有统计学意义后组间均数用两两比较方法，由统计软件SPSS11.5完成。
结果：1.集落细胞的形态学鉴定，原位联苯胺染色法证明所培养的是造血红系祖细胞。2.1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳显示RNA电泳图的5s,18s,28s三条带型整齐，无明显拖尾及弥散，说明RNA结构完整，无明显降解。3.逆转录PCR扩增三组均有目的基因HOXB6和内参照GAPDH基因的cDNA的产生，与DNA分子Marker相比示扩增产物大小分别为119bp和141bp。4.HOXB6基因mRNA在6个组即正常的红系祖细胞，HCMV感染后的红系祖细胞，以及ATRA和AS2O3处理过的红系祖细胞和先感染HCMV后用ATRA/AS2O3处理的红系祖细胞中定量表达情况，经过单因素方差分析和SPSS11.5forwindows统计分析结果显示，在正常培养体系中红系祖细胞随第3天，第7天，第10天时间推移持续表达HOXB6基因，且表达持续上调；在HCMV感染后，红系祖细胞HOXB6基因的表达随着第3天，7天，10天时间的推移与空白对照组比较，明显持续下调，即表达被抑制；ATRA组与空白对照组比较，能持续显著上调红系祖细胞的HOXB6基因的表达，且随着第3天，第7天，第10天时间延长，表达量逐渐升高；ATRA也能上调对HCMV感染后的第3天和第7天红系祖细胞的HOXB6基因的表达，但是ATRA对HCMV感染后的第10天红系祖细胞HOXB6基因的表达与空白对照组相比统计学上无显著差异；AS2O3与空白对照组比较，能随着时间推移逐渐下调红系祖细胞和HCMV感染后的红系祖细胞的HOXB6基因的表达，结果有统计学意义；与HCMV组比较，结果无统计学意义。
结论：1.HOXB6基因在脐血红系造血祖细胞中持续稳定的表达，且与红系造血有密切的相关性。2.HCMV感染能诱导脐血红系造血祖细胞HOXB6基因表达下调，HCMV有可能通过调控HOXB6基因表达异常而引起造血系统损害。3.ATRA和AS2O3可以调控HOXB6基因的表达。4.本实验采用Trizol试剂提取脐血红系造血祖细胞总RNA，所得产物RNA纯度高，完整性好，产物浓度无明显差异，无DNA污染，操作简便，适合于从细胞中提取总RNA的实验。5.本实验采用FQ-RT-PCR技术具有检测范围宽，敏感性高，精确度高，无PCR后处理步骤，避免了交叉污染，产出率高，可以进行多重检测的优点，该方法是一种对HOX基因在红系造血祖细胞表达进行定量或定性研究的理想方法，是当今研究mRNA表达水平较可靠的技术之一。