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杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）属于杜仲科杜仲属,为第三纪孑遗物种,其叶和树皮均可入药,是我国特有的传统中药材。杜仲富含多种药用功能成分。此外,杜仲还是重要的胶源植物。Dirigent蛋白不仅在植物次生代谢产物合成过程中发挥重要作用,还参与植物抗逆性。研究杜仲Dirigent基因可为杜仲的开发利用提供理论参考。本研究在本实验室前期构建杜仲基因组和转录组数据库基础上,克隆了一个杜仲Dirigent蛋白编码基因并定名为EuDIR3,对其进行遗传转化和表达分析研究。取得以下研究结果:1、EuDIR3基因克隆及序列分析以杜仲嫩叶为材料,提取其RNA并反转录成cDNA,以此为模板进行PCR扩增,克隆得到杜仲Dirigent编码基因（EuDIR3）。该序列长351 bp,不含内含子,编码116个氨基酸;分析表明EuDIR3与咖啡、菠萝和蓖麻等同源性较高;系统发育树分析则表明EuDIR3基因与黄胡萝卜和菠萝等亲缘关系更接近,与梅花和樱花较远;该基因编码的Dirigent蛋白分子量为11.84 kD,理论等电点为4.66,属于不稳定疏水性蛋白;在细胞质、线粒体和细胞核中均有分布,其中在细胞质中分布最多（56.5%）;软件预测该蛋白有22个可能的磷酸化位点、没有信号肽且不含跨膜结构;二级结构分析显示该蛋白没有α螺旋,有6个β折叠,β折叠由7个无规则卷曲连接。2、EuDIR3基因空间表达模式为了解析EuDIR3基因的空间表达特征,本研究以杜仲EF1α（蛋白翻译延伸因子,Elongation factor 1 alpha）为内参基因,应用Real-time PCR技术对杜仲花期的树皮、雌花和叶以及幼苗的根、茎和叶中EuDIR3基因相对表达量进行分析。结果表明在开花期EuDIR3基因在杜仲树皮中的表达量显著高于在雌花和叶中的表达量;对于杜仲幼苗,该基因在叶中的表达量最高,其次是根和茎。推测该基因在花期对树皮的影响较大,而在幼苗时期对叶的影响较大。3、EuDIR3基因原核表达载体构建及表达以pET-28a-NAD1为初载体,利用一步克隆法成功构建了原核表达载体pET-28a-EuDIR3。将构建好的重组质粒pET-28a-EuDIR3转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中,在21℃下以1 mmol/L异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导12 h后,得到大量目的蛋白,该蛋白主要集中在沉淀,为包涵体。以15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定该重组蛋白,在相对分子质量约15 kD处检测到1条特异性蛋白条带,即为表达出的重组蛋白EuDIR3。4、EuDIR3基因植物表达载体构建及对杜仲的遗传转化以pGM626-Act1-EuABP2为初载体,利用一步克隆法成功构建了以Act1启动的EuDIR3表达元件、Bar::GUS为筛选标记基因的植物表达载体pGM626-Act1-EuDIR3。为了提高杜仲不定芽的获得率及生根率,选用B5、MS和WPM 3种培养基,以杜仲下胚轴为外植体,利用农杆菌介导pGM626-Act1-EuDIR3和pSH737-35S-EuDIR1遗传转化杜仲,并将浸染后的各外植体分别接种于3种不同培养基上,观察记录各培养基上外植体的生长情况,通过GUS染色检测和PCR验证统计得到阳性芽数。结果表明:转化质粒在B5、MS和WPM培养基上的平均出芽率分别为14.79±6.20%、7.68±2.37%和4.05±0.64%,相较于MS和WPM培养基,B5培养基上的愈伤组织生长旺盛,色泽鲜艳呈绿色,质地紧密脆嫩,平均出芽率显著高于另外2种培养基,但是WPM培养基的生根率显著高于另外两种培养基,WPM和B5培养基的生根率分别为53.85%和3.57%,在MS培养基上的阳性芽并未生根。因此,在杜仲遗传转化过程中,B5培养基更适于诱导不定芽,WPM培养基利于不定芽生根。