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第一部分出生后不同时间点Connexin26基因敲除小鼠模型的建立和鉴定目的：建立及鉴定出生后不同时间点Connexin26基因敲除小鼠模型。方法：通过遗传学手段,将Cx26loxp/loxp转基因小鼠与工具鼠Rosa26CreER杂交获得Cx26lop/WT;Rosa26CreER子一代小鼠。子一代小鼠相互交配,获得Cx26loxp/loxp; Rosa26CreER子二代小鼠。分别在上述子二代小鼠出生后第1天(P1),第6天(P6)和第12天(P12)给予颈背部单次皮下他莫昔芬(tamoxifen, TMX)注射,获得出生后不同时间点Connexin26基因敲除小鼠模型。使用基因分型(genotyping)、蛋白印记(Western Blot)和免疫荧光技术检测小鼠的基因背景和蛋白敲除情况。使用听性脑干反应(auditory brainstem responses, ABR)检测小鼠听力。结果：Cx26loxp/loxp;Rosa26CreER小鼠可以稳定繁殖,体重和发育正常,毛色光亮,无明显退化现象。蛋白印记和免疫荧光技术确认3种不同时间点打药的小鼠耳蜗内Connexin26被广泛敲除。ABR结果显示P1和P6敲除组小鼠早期出现中重度耳聋,耳聋随时间推移稍有加重。P12敲除组小鼠早期听力损伤较轻,后期呈进行性加重的听力损伤。结论：我们成功的建立了出生后不同时间点Connexin26基因敲除小鼠的动物模型。第二部分出生后不同时间点Connexin26基因敲除小鼠耳蜗细胞长时程损伤模式的研究目的：研究和比较出生后不同时间点Connexin26小鼠耳蜗毛细胞损伤、Corti器(organ of Corti, OC)形态结构变化和继发性螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells, SGCs)死亡的模式。方法：使用基底膜铺片(n=3)和耳蜗轴位切片苏木素-伊红染色(n=3)来观察P1、P6和P12敲除组小鼠出生后1、3和5个月时耳蜗毛细胞凋亡模式和Corti器形态变化。采用螺旋神经节计数(n=3)的方法,比较上述不同实验组和对照组耳蜗螺旋神经节细胞不同时间的损伤程度。结果：基底膜铺片显示,P1和P6敲除组在出生后1个月耳蜗中回出现毛细胞大量死亡,随时间推移毛细胞死亡范围逐渐扩大到底回,中回损伤进一步加重。P12敲除组在出生后3个月出现耳蜗底回的少量毛细胞损伤。切片HE染色提示,P1组中回Corti隧道;tunnel of Corti, TC)不能开放并随时间推移出现支持细胞(supporting cell,SC)大量死亡,而P6和P12组可以正常打开。上述3组光镜下未见血管纹(striae vascularis, SV)、外侧壁和其他部位细胞明显异常。耳蜗螺旋神经节细胞计数提示,在毛细胞损伤对应部位,P1和P6敲除组出现继发性螺旋神经节细胞死亡,P12组未见明显螺旋神经节细胞死亡。结论：出生后Connexin26早期敲除组小鼠毛细胞、支持细胞和螺旋神经节细胞的损伤程度和范围明显大于出生后晚期敲除组,提示Connexin26在出生后耳蜗的早期发育中起到重要作用,而在出生后耳蜗晚期发育中的作用是可替代的。第三部分出生后早期Connexin26敲除小鼠耳蜗细胞损伤与葡萄糖转运障碍的研究目的：探究出生后早期Connexin26敲除小鼠耳蜗细胞损伤与葡萄糖转运子(glucose transporter, GLUT)变化和细胞能量代谢的关系。方法：使用蛋白印记技术检测1月龄出生后第一天(P1)降低Connexin26表达组小鼠(n=5)与对照组(n=5)耳蜗磷酸化AMPK蛋白表达变化情况。采用实时定量PCR技术检测上述小鼠耳蜗不同葡萄糖转运子的表达变化。结果：1月龄P1敲除组小鼠和对照组小鼠耳蜗磷酸化MPK蛋白表达差异无统计学意义。P1敲除组小鼠和对照组小鼠耳蜗GLUT1、GLUT8和GLUT10在mRNA水平上表达无统计学意义。结论：出生后第一天敲除组小鼠耳蜗细胞损伤可能与细胞葡萄糖能量代谢障碍无明显相关性。出生后降低Connexin26表达对耳蜗葡萄糖转运子GLUT1、GLUT8和GLUT10表达无明显调节作用。