酶催化具有高效性、高选择性、反应条件温和、环保等优点,已经被广泛应用于化工、医药等有机合成反应中。酶作为一种高效的催化剂,不仅具有专一性,还具有催化的多功能性,即可以催化除了天然反应以外的一种甚至多种反应。近年来,酶的多功能性催化研究发展迅速,在很多手性药物的合成中被广泛应用并已取得越来越多科学家的关注。但从近年来的报道来看,酶在催化效率和立体选择性上的局限性仍然是阻碍其发展的主要障碍。因此,酶的多功能性催化已成为一个极具挑战和吸引力,又有深远意义的研究课题。已经有多种属于脂肪酶家族的水解酯键的酶类被发现具有非特异性催化能力。本文研究的ST0779来自于POP肽酶家族,该肽酶家族具有和脂肪酶类似的α/β水解催化结构域。本实验室已经首次报道了ST0779具有催化羟醛缩合和亨利反应的能力。综合比较其催化亨利反应产率以及对映体选择性,是已报道的酶中最好的。本文应用点突变(催化三联体和第525位氨基酸残基的突变)进一步探索ST0779催化多功能性的反应机理以及其具有多功能性催化活性的原因。结果表明,突变后对酶催化反应的对映体选择性有较大的影响。本文中以重组质粒p ET-28a-ST0779为模板,通过全质粒PCR手段获取含有突变位点的重组质粒,经DpnⅠ消化模板后将其转入克隆菌E.coli DH5α中。提取质粒并测序,成功得到了ST0779的催化三联体点突变的突变体S439A,D523A和H555A,以及第525位的突变体R525V和R525E。用这些突变体重组质粒转染E.coli BLP感受态细胞,构建突变体表达工程菌。为了得到大量目的蛋白,对突变体表达和纯化条件进行优化。诱导目的蛋白表达的最佳温度是30℃,最佳IPTG终浓度为0.1m M,表达时间8h。得到的粗蛋白液在80℃条件下,热处理30min后,高速离心即得到纯度90%以上,分子量为63 k Da的蛋白液,冻干成蛋白粉后,即可用于酶催化活性的表征。对于酶的主活力,采用氯化镉-茚三酮法测定酰基氨肽酶活力;以对硝基苯酚酯作为酯酶水解底物测定酯酶活性。同时测定酶催化Henry加成反应的活性,即0.1 m M对硝基苯甲醛,15倍当量的硝基烷烃,0.0064μM的酶溶于1ml水溶液和4ml叔丁基甲基醚(TBME)中,利用薄层层析(TLC)定性检测反应。Henry反应的产物利用质谱(MS)和核磁共振技术(NMR)进行鉴定,产率的测定利用HPLC串联C18色谱柱,对映体过量值利用手性柱串联HPLC系统并通过蒸发光检测器测得。结果显示活性中心的催化三联体和活性中心附近第525位氨基酸残基的突变对该酶的主活力有很大影响,尤其是催化三联体单点突变体,已经完全丧失了其肽酶和酯酶的活力。在利用较长链硝基烷烃(硝基乙烷和硝基丙烷)为底物的Henry加成反应中,第525位的突变体R525V和R525E在反应产率上较野生型酶低17-25%,而催化三联体单点突变体对反应产率无明显影响。实验结果同样表明了这五种突变体,对该反应(硝基丙烷底物)的对映体选择性产生了较大的影响,对映体过量值均有显著降低。为了进一步探究ST0779催化Henry加成反应的催化机理,利用分子对接来模拟ST0779结合底物的关键位点。用Modeler of Insight II软件,同源建模构建ST0779野生型和五种突变体的三维结构。用Auto Dock Vina软件进行分子对接,对接用底物小分子分别为硝基乙烷,对硝基苯甲醛和2-硝基-1-对硝基苯丙醇。结果得到的Top 3最优构象中,参与底物结合的氨基酸残基也没有催化三联体。综合酶活性表征和分子模拟实验,证明了ST0779催化Henry加成反应极可能存在另一个新的活性口袋,为继续研究ST0779非特异性催化反应机理及其相应的催化位点,发掘新的多功能酶打下基础。