1、研究背景疼痛(pain)包括痛觉和痛反应,是临床上大多数疾病共有并最常见的症状之一,主要表现为机体对损伤组织或潜在的损伤所产生的一种不愉快的反应。在临床上,疼痛的分类十分复杂。按疼痛的性质、起因和时程,疼痛可分为急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛主要表现为疾病或组织损伤所致的急性症状,为各种伤害性刺激作用于机体伤害性感受器而导致的疼痛,故又称之为伤害感受性疼痛。临床上常见于手术创伤、烧伤、烫伤、急性炎症、心肌梗死、脏器穿孔、分娩等引起的疼痛。而慢性疼痛是指引起伤害性刺激的损伤痊愈而疼痛却依然存在的一种状态,临床表现为其本身就是一种疾病,常见于神经源性疼痛(神经病理性疼痛)、慢性腰腿痛、晚期癌性痛等。另外,基于病理学特征,可将疼痛划分为伤害感受性疼痛(nociceptive pain)和神经病理性疼痛(neuropathic pain)。伤害感受性疼痛的产生与组织损伤或炎症有关,又称为炎症性疼痛,属于急性疼痛。而神经病理性疼痛属于慢性疼痛,其产生机制比较复杂,主要是由于外周或中枢神经系统的直接损伤或功能紊乱所引起。疼痛表现为人对伤害性刺激的一种主观感受,常常与其他疾病伴随发生,如果伴随神经异常,则提示可能存在神经病理性因素或神经损伤等,而表现为神经病理性疼痛,为临床最常见的难治性疼痛。神经病理性疼痛分类复杂、类型较多,主要分为周围性神经病理性疼痛和中枢性神经病理性疼痛。临床上,神经病理性疼痛通常表现为一种慢性疾病,比较难诊断,而且尚缺乏有效的治疗措施,常规止痛药一般不能有效缓解疼痛,因此很难治愈。因此,临床上常常面临着治疗无效或效果不佳的尴尬,给患者带来了极大的痛苦,严重影响患者正常工作和日常生活,极大地降低患者的生活质量,对医疗服务亦是个巨大的负担。烧伤是临床常见的一种严重的急性创伤,常伴有剧烈疼痛。烧伤、烫伤引起的疼痛是一种特殊类型的急性外伤性疼痛,一般在烧伤、烫伤后最初1小时内出现,并伴随着出现在烧伤后的整个治疗过程中。严重烧伤后将导致严重而且持续性的疼痛(基础痛),并且还要在数周乃至数月内经历令人难以忍受的创面处理引起的疼痛(操作痛)。烧伤痛是烧伤患者所经历的最难以忍受的痛苦和最常见的临床症状,其控制不当将可导致患者的精神预后不良,甚至有自杀行为和暴力倾向,而且严重的会引起烧伤病人并发症的产生甚至死亡。但目前临床上对烧伤痛的治疗远不尽人意,寻找更有效、更实用和更经济的方法治疗烧伤痛,成为烧伤治疗的重要组成部分。目前,国际上认为疼痛是继呼吸、脉搏、血压、体温之后的第五个生命体征,为生命体征的重要指标；疼痛治疗亦成为现代医学的一个重要组成部分,并已逐渐发展成为疼痛治疗学。然而,目前化学药物镇痛仍是最主要的疼痛治疗手段,主要包括阿片类镇痛药、中枢作用的非阿片类镇痛药、作用于外周的抗炎镇痛药和复方抗炎镇痛药。但阿片类等镇痛药物的副作用,如呼吸抑制、恶心、呕吐、嗜睡、尿潴留等发生率较高,而且长期应用易产生药物耐受与依赖以及突然停药导致的戒断综合征等。因此,在临床上如何规范疼痛治疗是每一位医师必须认真对待的问题,寻找以新的镇痛药物成为目前医务工作者的研究热点和面临的首要任务。研究发现,伤害感受器上表达许多与疼痛和感觉过程有关的分子,特别是嘌呤受体中的P2X3受体在背根感觉神经元特异表达,与感觉神经末梢释放的ATP(P2X受体激动剂)结合而参与疼痛的信息传递,由此表明脊髓背根初级感觉神经元在疼痛的感知和传递中发挥着重要的作用。嘌呤与嘧啶受体包括P1和P2受体,腺苷为腺嘌呤核苷酸前体和代谢产物,主要激活P1受体,而ATP及其类似物作用于P2受体。一般认为,外周神经损伤、伤害性刺激等使损伤细胞、应激细胞以及感觉神经末梢本身释放大量ATP,刺激感觉神经元P2X2/3受体或P2X3受体,使感觉神经末梢去极化,引起感觉神经元放电增强而产生痛觉。由此提示,不同类型细胞释放的ATP能通过激活感觉神经终末上的P2受体(尤其是P2X3受体或P2X2/3受体),在疼痛的发生机制中起到一定作用。因此,P2嘌呤受体的激动剂和拮抗剂具有广阔临床应用前景,特异性的P2X3受体阻断剂将可能成为痛觉等病理状态下新的治疗药物。葛根为豆科植物野葛的干燥根,气味甘、辛、平,无毒；具清热解毒、升阳解肌、透疹止泻之功效。而葛根素(Puerarin)是从葛根中提取的一种黄酮苷,化学名为4,7-二羟基-8-β-D-吡喃葡萄糖醛基异黄酮,临床上主要用于心肌梗塞、冠心病、心绞痛等心血管疾病及视网膜动/静脉阻塞、突发性耳聋和糖尿病等病症的治疗。文献报道,以葛根为主药的葛根汤具有抗炎作用；关节腔内联合注射类固醇和葛根素可显著地提高骨关节炎治疗的远期疗效。疼痛是炎症的表现,而炎症与伤害性反应密切相关,由此提示从葛根中提取的葛根素可能具有抗伤害性反应和镇痛的作用。本实验将通过建立大鼠坐骨神经慢性压迫损伤(CC1)和浅Ⅱ度烧伤模型,观察葛根素对实验模型大鼠的机械痛敏和热痛敏等行为学的影响,同时采用免疫组化、原位杂交、RT-PCR和Western Blot技术观察葛根素对P2X3受体介导的神经病理性疼痛和烧伤痛的作用；并结合急性伤害性行为学研究,观察葛根素对P2X3受体介导的大鼠急性伤害性反应的影响。通过这些实验以期了解葛根素对初级感觉神经细胞P2X3受体介导的神经病理性疼痛、烧伤痛和急性伤害性疼痛的作用,扩大中药葛根素的应用范围,为临床上神经病理性疼痛、烧伤痛和急性伤害性疼痛等急、慢性疼痛的防治探寻新的镇痛药物提供实验依据。2、葛根素对P2X3受体介导的急性伤害性反应的作用目的：观察葛根素(puerarin, PUE)对初级感觉神经细胞嘌呤2X3 (P2X3)受体介导的急性伤害性反应的影响。方法：通过大鼠痛行为反应确定鞘内应用葛根素对P2X3受体激动剂ATP、α,β亚甲三磷酸腺苷(α,β-meATP)和福尔马林(formalin)所致大鼠足底伤害性反应的影响；同时应用免疫组化和RT-PCR方法,观察葛根素对炎性物质福尔马林所致伤害性行为反应大鼠的L4-L6段背根神经节(dorsal root ganglion, DRG) P2X3受体表达的影响。结果：足底局部皮下分别注射ATP (10μmol/L)、α,β-meATP(1μmol/L)或formalin(2.5%)后产生明显的急性伤害性反应；鞘内注射ATP(10μmol/L)或α,β-meATP(1μmol/L)能分别加强足底局部皮下注射ATP (10μmol/L)或α,β-meATP(1μmol/L)所产生的急性伤害性反应；鞘内注射葛根素(10mmol/L)能明显抑制足底注射2.5%formalin所致的大鼠足底急性伤害性反应；鞘内注射葛根素(10mmol/L)能明显抑制鞘内注射ATP所加强大鼠足底急性伤害性反应；鞘内注射不同浓度的葛根素(2、10、50mmol/L)呈剂量依赖性地抑制鞘内注射α,β-meATP所加强的大鼠足底急性伤害性反应；DRG免疫组化和RT-PCR实验结果显示葛根素可明显减少足底皮下注射福尔马林引起的DRG中P2X3受体蛋白和mRNA的上调表达。结论：葛根素可通过抑制初级感觉神经元P2X3受体兴奋介导的伤害性信号传递产生抗伤害性反应作用。3、葛根素对P2X3受体介导的神经病理性疼痛的作用目的：观察葛根素对P2X3受体介导的神经病理性疼痛的作用。方法：建立大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(Chronic constriction injury,CCI)模型(结扎右后肢),实验大鼠随机分为正常大鼠对照组(Ctrl)、假手术对照组(Sham)、正常大鼠葛根素处理对照组(Ctrl+PUE)、CCI模型组(CCI)和CCI模型+葛根素处理组(CCI+PUE)等5组。应用Von Frey细丝法和热辐射法观察葛根素对CCI大鼠机械缩足反射阂值(mechanical withdrawal threshold, MWT)和热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency, TWL)的影响,结合免疫组化、蛋白印迹、原位杂交和]RT-PCR方法观察各组实验大鼠右侧(即结扎侧)L4/L5段背根神经节(dorsal root ganglion, DRG) P2X3受体蛋白和mRNA表达的变化。结果：术后4-7 d,神经病理性疼痛大鼠模型基本形成,CCI大鼠模型组和CCI+PUE组大鼠右后爪(结扎侧)的机械和热痛敏阈值明显降低,与Sham对照组、Ctrl+PUE对照组和Ctrl对照组比较有显著性意义(p<0.01),而：Sham对照组、Ctrl+PUE对照组和Ctrl对照组之间相比较无显著性差异(p>0.05)；术后7-10 d,CCI+PUE组的MWT和TWL明显升高,与CCI大鼠模型组相比有明显的差异性(p<0.01),与Ctrl对照组之间相比较无显著性意义(p>0.05)；术后14 d,各组实验大鼠DRG的免疫组化、蛋白印迹、原位杂交和RT-PCR等实验结果显示：与Sham对照组、Ctrl+PUE对照组和Ctrl对照组相比,CCI模型组大鼠右侧L4/L5段背根神经节P2X3受体蛋白和mRNA的表达明显升高(p<0.05或0.01),而CCI+PUE组背根神经节P2X3受体蛋白和mRNA的表达较CCI大鼠模型组的低(p<0.05或0.01)。结论：葛根素对初级感觉神经元P2X3受体介导的神经病理性疼痛具有抑制作用。4、葛根素对P2X3受体介导的烧伤痛的作用目的：探讨葛根素对P2X3受体介导的烧伤痛的作用。方法：建立大鼠浅Ⅱ度烧伤动物模型(右后肢或背部烫伤),实验大鼠随机分成10组,每组6只。其中足部假烫组(Sham paw burn, SPB)、无足部烫伤葛根素处理对照组(puerarin-treated paw unburned control, PPC)、足部浅Ⅱ度烫伤组(untreated superficial second degree paw burn, UPB)、足部浅Ⅱ度烫伤葛根素处理组(puerarin-treated superficial second degree paw burn, PPB)和足部烫伤空白对照组(blank paw control, BPC)用于行为学研究,背部假烫组(sham back burn, SBB)无背部烫伤葛根素处理对照组(puerarin-treated back unburned control,PBC)、背部浅Ⅱ度烫伤组(untreated superficial second degree back burn, UBB)、背部浅Ⅱ度烫伤葛根素处理组(puerarin-treated superficial second degree back burn, PBB)和背部烫伤空白对照组(blank back control,BBC)用于免疫组化、原位杂交或分子生物学等研究。应用Von Frey细丝法和热辐射法测定各组实验大鼠右后肢机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL),观察葛根素对浅Ⅱ度烧伤大鼠MWT和TWL的影响。结合免疫组化、蛋白印迹、原位杂交和RT-PCR方法分别观察各组大鼠背部烫伤区背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)P2Χ3受体蛋白和]nRNA的表达变化。结果：烫伤后,足部浅Ⅱ度烫伤组(untreated superficial second degree paw burn, UPB)、足部浅Ⅱ度烫伤葛根素处理组(puerarin-treated superficial second degree paw burn, PPB)大鼠右后爪的机械和热痛敏阈值明显降低,与足部假烫组(sham paw burn, SPB)、无足部烫伤葛根素处理对照组(puerarin-treated paw unburned control, PPC)、和足部烫伤空白对照组(blank paw control, BPC)比较有显著性意义(p<0.01),而足部假烫组(SPB)、无足部烫伤葛根素处理对照组(PPC)、和足部烫伤空白对照组(BPC)之间相比较无显著性差异(p>0.05)；与UPB组相比,PPB组的MWT和TWL分别于烫伤后48h和1h明显升高,并有明显的差异性(p<0.05)；烫伤后96h,PPB组的MWT和TWL与SPB、PPC和BPC组之间相比较无显著性差异(p>0.05),而UPB组的MWT和TWL仍然很低(P<0.01)；烫伤3d后,各组实验大鼠DRG的免疫组化、蛋白印迹、原位杂交和RT-PCR等实验结果显示：背部假烫组(sham back burn, SBB)、无背部烫伤葛根素处理对照(puerarin-treated back unburned control, PBC)和背部烫伤空白对照组(blank back control, BBC)相比,背部浅Ⅱ度烫伤组(untreated superficial second degree back burn, UBB)大鼠背根神经节(DRG) P2X3受体的蛋白和mRNA的表达明显升高(P<0.01),而背部浅Ⅱ度烫伤葛根素处理组(puerarin-treated superficial second degree back burn,PBB)背根神经节(DRG)P2X3受体蛋白和mRNA的表达较UBB组低(P<0.05或0.01),与SBB、PBC和BBC组比较无显著性差异(p>0.05)。结论：葛根素可缓解初级感觉神经元P2X3受体所介导的烧伤痛。