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第一部分绿原酸减轻脂肪酸诱导的HepG2细胞脂质沉积实验目的:既往研究表明,绿原酸可调节机体糖脂代谢,提高胰岛素敏感性。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)被认为是代谢综合征在肝脏的表现,绿原酸对其作用尚不明确。本研究旨在利用体外实验来初步探讨绿原酸对NAFLD的作用及其分子机制。材料和方法:体外实验选取人肝癌细胞株HepG2细胞,采用游离脂肪酸(FFA)刺激48h诱导NAFLD体外细胞模型,采用不同浓度的绿原酸刺激HepG2细胞来观察绿原酸体外刺激对肝细胞脂质沉积的影响。利用Western Blot及荧光定量PCR(qRT-PCR)等手段检测相关通路蛋白表达及其mRNA水平。采用小干扰RNA(siRNA)技术或药物抑制剂来对通路各靶点进行基因敲减或药物抑制。利用肝细胞甘油三酯含量测定和油红0染色评价肝细胞脂质沉积的情况。结果:本研究通过体外实验发现:给予50μM绿原酸刺激HepG2细胞24小时,可减轻FFA诱导的肝细胞脂质沉积。通过分别对SIRT1、AMPK和LKB1进行药物抑制或siRNA基因敲减预处理,可阻断绿原酸对肝细胞脂质沉积的保护作用。绿原酸减轻脂质沉积的作用首先是通过上调SIRT1蛋白表达,增加其去乙酰化活性;再通过磷酸化激活LKB1,由其介导并向下磷酸化激活AMPK;继而上调脂质氧化蛋白MLYCD和CPT1α的表达促进脂肪酸β氧化,同时降低脂质合成蛋白SREBP1c和FAS的表达抑制脂质合成。结论:本实验证实绿原酸可能通过SIRT1-LKB1-AMPK通路减轻FFA诱导的HepG2细胞脂质沉积。第二部分绿原酸减轻高脂饮食诱导的小鼠肝脏脂质沉积实验目的:结合第一部分体外实验中初步确立的绿原酸保护肝细胞脂质沉积作用及其机制,我们利用小鼠在体试验来验证绿原酸的作用及分子通路。材料和方法:体内实验选取5-6周龄的C57BL/6小鼠,分别采用正常饮食、正常饮食添加绿原酸、高脂饮食、高脂饮食添加绿原酸喂养8周观察绿原酸对高脂饮食诱导的小鼠肝脏脂质沉积的影响。利用肝脏组织甘油三酯含量测定、H&E或油红O染色来评价肝脏脂质沉积的情况。利用Western Blot及qRT-PCR等手段检测相关通路蛋白表达及其mRNA水平。结果:在高脂饮食的同时,饮水中添加绿原酸喂养8周可减轻由高脂饮食造成的肝脏脂质沉积。结合第一部分结果,对SIRT1-LKB1-AMPK信号通路进行验证:绿原酸可增加SIRT1蛋白表达,上调LKB1、AMPK及ACC的磷酸化水平,在下游功能蛋白中,脂质氧化蛋白MLYCD和CPT1α的mRNA水平和蛋白表达皆增加,而脂质合成蛋白SREBP1c和FAS的mRNA水平和蛋白表达都呈下降趋势。结论:绿原酸可能通过SIRT1-AMPK信号通路,减轻高脂饮食诱导的小鼠肝脏脂质沉积。本研究支持绿原酸可能作为未来NAFLD临床预防和治疗的潜在靶点。