第一部分丙戊酸诱导人三阴性乳腺癌细胞凋亡及其机制研究目的:丙戊酸(VPA)系一临床广谱抗癫痫药;作为一组蛋白去乙酰化酶抑制剂,近年来诸多研究还表明其对多种肿瘤均具有较强的抗癌活性,但其确切的作用机制尚未完全阐明。鉴于目前临床上对三阴性乳腺癌的治疗手段尚有限,现有的治疗方案的临床疗效也比较局限,因此本研究第一部分的主要目的在于从体外细胞水平探讨VPA对三阴性乳腺癌可能的治疗作用,并初步探索相关的分子机制。方法:1、MTS 方法检测不同浓度的 VPA(0、0.125、0.25、0.5、1、2 mmol/L)作用于人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT20 72h后细胞的存活情况,绘制细胞生存曲线进行比较分析。2、细胞克隆形成实验检测不同浓度的VPA(0、0.125、0.25、0.5 mmol/L)作用于人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT20后细胞的克隆形成数量,绘制平均克隆数百分比曲线进行分析比较。3、Western Blotting法检测相同浓度的VPA(0.5 mmol/L)分别作用24h或48h后人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT20细胞凋亡相关蛋白PARP的降解水平,并对C-PARP的蛋白条带进行灰度扫描半定量值绘图以进行分析比较。4、Western Blotting法检测相同浓度的VPA(0.5 mmol/L)分别作用24h或48h后对人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT20细胞的相关信号通路关键蛋白表达水平或磷酸化激活的影响,并对关键的蛋白条带进行灰度扫描半定量值绘图以进行分析比较。5、Western Blotting 法检测不同浓度 VPA(0、0.25、0.5、1mmol/L)作用相同时间(24h)后对人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT20细胞的相关信号通路关键蛋白表达水平或磷酸化激活的影响,并对关键的蛋白条带进行灰度扫描半定量值绘图以进行分析比较。6、普通RT-PCR及实时荧光定量RT-PCR法检测关键蛋白EGFR和Survivin基因mRNAs的表达水平是否发生有统计学意义的变化,并绘制mRNA相对表达量柱状图以进行分析比较。结果:1、MTS结果显示:与未处理对照组相比,两株人三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231和BT20)均随着VPA作用浓度的递增而细胞存活率逐渐递减,组间差异有显著的统计学意义(P<0.05);VPA对MDA-MB-231和BT20的半数致死量(IC50)分别为 0.4137 mmol/L 和 0.8262 mmol/L。2、细胞克隆形成实验结果进一步表明:随着VPA作用浓度的递增,两株人三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231和BT20)的细胞生长增殖明显受抑制,组间差异有显著的统计学意义(P<0.05)。3、Western Blotting 检测 PARP 蛋白降解结果显示:VPA(0.5 mmol/L)作用24h后即可显著诱导三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231和BT20)的凋亡;对MDA-MB-231细胞而言,随着VPA作用时间的延长,细胞凋亡的诱导作用愈明显。4、Western Blotting检测表皮生长因子受体(EGFR)表达水平及其下游信号通路激活情况的结果显示:VPA作用可显著诱导三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231和BT20)中EGFR表达水平的下调,同时抑制其下游PI3K/Akt信号转导通路的激活,表现为Akt的磷酸化水平即p-Akt与未处理对照组明显降低;VPA诱导MDA-MB-231和BT20中EGFR表达水平下调及其下游PI3K/Akt信号转导通路的抑制效应呈明显的作用时间和剂量依赖性。此外,在BT20中,尚能观察到EGFR下游的ERK信号通路也随着VPA作用时间的延长或作用浓度的增高而被抑制得愈加明显。5、有趣的是,Western Blotting检测结果还显示:VPA作用可显著诱导三阴性乳腺癌细胞(MDA-MB-231和BT20)中抗凋亡蛋白Survivin的表达下调,这种效应同样呈作用时间和剂量依赖性。6、普通RT-PCR及实时荧光定量RT-PCR结果均显示:VPA作用于人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT20后其EGFR及抗凋亡蛋白Survivin的mRNAs表达水平与未处理对照组无明显差异,提示VPA下调EGFR及抗凋亡蛋白Survivin的表达可能是通过转录非依赖性机制调控的。结论:VPA作用在体外细胞水平能够显著抑制人三阴性乳腺癌细胞的生长增殖并诱导其凋亡,且VPA诱导三阴性乳腺癌细胞的凋亡呈明显的作用时间和剂量依赖性。初步的VPA作用分子机理探索提示:VPA可能通过转录非依赖性机制的介导同时下调三阴性乳腺癌细胞中EGFR和Survivin蛋白的表达,一方面,EGFR的表达下调致其下游PI3K/Akt和ERK信号转导通路的抑制;另一方面,Survivin蛋白的表达下调直接导致细胞的凋亡抗性降低;二者综合作用进而诱导细胞凋亡。第二部分丙戊酸增强人三阴性乳腺癌细胞对泰素诱导凋亡的敏感性及其机制研究目的:泰素(Paclitaxel或Taxol)是目前临床上三阴性乳腺癌治疗常用的一线化疗药,但是在实际的治疗过程中,三阴性乳腺癌患者接受治疗的后期往往会对化疗药物产生不敏感现象,这也是导致泰素临床治疗失败的主要原因之一;因此,寻找能够增强肿瘤细胞对泰素敏感性的药物具有重要意义。基于我们第一部分的研究结果,本部分我们的主要研究目的在于体外细胞水平上初步探讨VPA与泰素在人三阴性乳腺癌治疗中可能的协同作用,并冀望能初步揭示其可能的分子机制。方法:1、MTS方法检测不同浓度的泰素(0、2、4、8、16、32nmol/L)单独和不同浓度的泰素联合VPA(0.25 mmol/L)作用于人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-23172h后细胞的存活情况,绘制细胞生存曲线进行比较分析。2、Western Blotting法检测对照组、VPA单独作用、泰素单独作用及VPA和泰素联合作用对人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞凋亡相关蛋白PARP降解的影响,并对C-PARP的蛋白条带进行灰度扫描半定量值绘图以进行分析比较。3、通过分子克隆法自行构建EGFR敲低慢病毒载体;经鉴定构建成功的pLKO.1-EGFR_shRNA和基因敲低对照载体pLKO.1-SHC002分别与包装质粒psPAX2和pMD2.G 一起导入HEK293T细胞以包装成慢病毒,常规法收集病毒上清备用。4、经慢病毒感染并嘌呤霉素筛选法敲低两株人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT20中的EGFR的表达,并行Western Blotting实验鉴定敲低效果。5、MTS方法检测EGFR敲低与没敲低三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT20经不同浓度的泰素(0、2、4、8、16、32 nmol/L)作用72h后细胞的存活情况,并绘制细胞生存曲线进行比较分析。6、细胞克隆形成实验检测EGFR敲低与没敲低三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT20在泰素(2.5 nmol/L)作用后细胞的生长增殖情况,计数克隆形成数量,绘制平均克隆数百分比曲线进行分析比较。7、Western Blotting实验检测EGFR敲低与没敲低对VPA和泰素单独作用于人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡相关蛋白PARP降解的影响,并对C-PARP的蛋白条带进行灰度扫描半定量值绘图以进行分析比较。结果:1、MTS实验结果显示:与泰素单独作用组相比,VPA和泰素联合作用能明显抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长增殖,两组间的差异具有显著的统计学意义(P<0.05);同时,Western Blotting实验结果也表明:在人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中,与对照组相比、VPA单独作用组及泰素单独作用组相比,VPA和泰素联合作用能显著增强细胞凋亡,表现为凋亡相关蛋白PARP的降解水平明显升高;上述综合结果提示VPA具体外细胞水平协同增强人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231对泰素的敏感性。2、重组质粒酶切鉴定结果表明,所构建的EGFR敲低慢病毒载体pLKO.1-EGFR_shRNA符合预期设计;慢病毒包装及感染和EGFR敲低效果的鉴定也证实所建立的慢病毒系统可成功介导三阴性乳腺癌细胞中EGFR的表达敲低。3、MTS实验和细胞克隆形成实验结果显示:EGFR敲低后,人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT20均对泰素作用更为敏感;Western Blotting实验结果则表明:在人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中,EGFR敲低后细胞对泰素诱导的凋亡敏感性明显增强;这些结果提示VPA协同增强泰素抗三阴性乳腺癌活性可能与其介导的EGFR表达下调密切相关。结论:VPA具体外细胞水平上协同增强泰素抗三阴性乳腺癌的活性,其主要作用机制可能是VPA通过特异性下调三阴性乳腺癌细胞中EGFR的表达,进而增强其对泰素诱导凋亡的敏感性。综合而言,我们的研究为临床上VPA作为治疗三阴性乳腺癌可能的联合用药提供了初步的理论基础和实验依据。