论文部分内容阅读
本研究从一株广东鸭源禽流感病毒A/duck/Guangndong/2003(H5N1)中提取核酸,运用PCR方法,获得血凝素(HA)基因片断,约1800bp,回收PCR获得的目的片段,并将HA基因连接到克隆载体PMD18-T上,获得新的质粒,命名为PMD18-T-HA,测序结果表明所获得的序列全长1851bp,包含了HA基因的完整阅读框及起始密码子和终止密码子。将质粒PMD18-T-HA与pDsRed2均用限制性内切酶酶切,并将HA基因片段与pDsRed2质粒载体连接,获得新的质粒命名为PHD1。 同时,从马立克病毒(MDV)1型标准株中提取MDV核酸,运用PCR方法,获得US1,US2片断,按克隆载体PMD18-T的说明书将US1,US2分别连接到克隆载体PMD18-T上,得到新的质粒PMD18-T-US1,PMD18-T-US2。将阳性克隆进行序列测定和分析,结果表明所获得的US1全长1147bp,US2全长1246bp。将质粒PMD18-T-US1和PUC19均用限制性内切酶酶切,然后将US1连接到质粒PUC19的多克隆位点,组成新的质粒命名为PUCF1,构建成功后,将质粒PMD18-T-US2中的US2基因片断通过限制性内切酶酶切,并连接到质粒PUCF1上,,组成新的质粒命名为PUCF120。 以质粒PHD1为模板,设计引物扩增包含HA阅读框和荧光红的显色基因的目的片段,并将其克隆到载体pGEM—TEasy,然后通过限制性内切酶将目的片段和新构建的质粒PUCF12酶切,用T4连接酶进行连接,成功构建了最终质粒RHAF12。 总之,本研究通过一系列PCR,回收,连接,转化等试验方法,将所得到的HA,US1,US2基因和载体PUC19,pDsRed2连接,构建了目的质粒,为今后的禽流感基因工程苗的研究奠定了坚实的基础,也为我国禽流感防治工作提供了强大的科学依据。