论文部分内容阅读
临床上，急性移植排斥反应主要通过免疫抑制药物进行治疗。FK506是预防和治疗同种异体移植排斥反应的有效免疫抑制剂，其作用机制是抑制T淋巴细胞的活化与增殖。口服或静脉用药后，FK506随血液分布于全身各组织脏器，不能有效作用于富含T淋巴细胞的区域，因此不能发挥最大的疗效，且长期应用，其全身毒副作用不可避免。因此，改善药物在体内的分布，提高药效的同时降低毒副作用，是当前治疗急性移植排斥反应的关键研究方向之一。本研究基于介孔硅纳米材料，结合T淋巴细胞表面特异性表达的CD3分子，构建了一种安全有效的载FK506靶向介孔硅纳米复合物，探讨其体外靶向抑制T淋巴细胞增殖与炎性因子分泌的作用。本研究分为以下两个部分：
第一部分靶向载药介孔硅纳米粒的制备及其表征分析
目的
制备携CD3抗体载FK506的介孔硅纳米粒，对其理化特性进行分析评价。
方法
采用模板合成法制备介孔硅纳米粒(mesoporous silica nanoparticles , MSNs)。利用有机溶剂挥干法将FK506装载于MSNs内。将生物素化磷脂与MSNs共孵育，利用脂质体融合原理，制备磷脂包被的MSNs。通过生物素-亲和素-生物素连接法，将生物素化CD3抗体和同型对照抗体连接到磷脂包被的MSNs表面，制备携CD3抗体或同型对照抗体的载药介孔硅纳米粒(FK506-MSNCD3、FK506-MSNcon)。使用DLS、SEM、TEM及比表面积孔径分析仪评价纳米材料的粒径、电位、稳定性、形态和孔径。流式细胞仪和荧光显微镜检测MSNs磷脂包被和抗体的连接。使用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)和热差重分析(Thermo Gravimetric Analyzer,TGA)评估载药率和包封率，透析法分析体外药物释放。
结果
⑴通过模板法成功合成了MSNs，并成功制备出FK506-MSNCD3、FK506-MSNcon。DLS显示FK506-MSNCD3、FK506-MSNcon平均粒径分别为327.30±7.60nm、322.70±6.00nm。两者在粒径、电位及PDI等方面未见明显差异。SEM和TEM观察FK506-MSNs呈圆球状，分布均匀，大小均一，无明显聚集现象。
⑵流式细胞学检测显示超过85%MSNs成功包裹生物素化磷脂膜。
⑶DiI-MSNCD3与FITC标记的荧光二抗孵育后，荧光显微镜下可见大量的绿色荧光，且与标记MSNs的DiI红色荧光共定位。
⑷比表面积及孔径分析仪检测，单纯MSNs的比表面积、总孔体积、孔径分别为777.64m2/g、0.94cm3/g、3.0nm。载药之后，FK506-MSNs的比表面积、总孔体积、孔径分别减小至570.70m2/g、0.49cm3/g、2.5nm。
⑸TGA检测MSNs、FK506-MSNs、FK506-MSNCD3三组从0℃升温到800℃的过程中，失重所占百分比分别为14%、78%、86%，计算出FK506-MSNCD3的载药率和包封率分别约为76.83%、68%。
⑹HPLC检测FK506-MSNCD3载药率和包封率分别为75.86±0.65%、63.25±2.85%，与TGA所得的结果相近。体外药物释放实验显示，FK506-MSNCD3与FK506-MSNcon体外释放过程相似，约72h时达到平台期，药物累积释放率各为58.07±6.86%、56.21±3.50%，两者无统计学差异(P＞0.05)。
结论
本研究成功制备了靶向载药纳米体系(FK506-MSNCD3)，粒径均一且具备良好稳定性，体外能缓慢释放其负载的药物。
第二部分纳米粒体外粘附及对T淋巴细胞功能抑制实验
目的
评价靶向载药介孔硅纳米粒与T淋巴细胞的粘附能力，及其对T淋巴细胞增殖和炎性因子分泌的抑制作用。
方法
使用阴选磁珠试剂盒分离提纯大鼠T淋巴细胞，流式细胞仪检测T淋巴细胞纯度。CLSM观察DiI-MSNCD3和DiI-MSNcon与T淋巴细胞的粘附，流式细胞检测仪定量评估DiI-MSNCD3、DiI-MSNcon与T淋巴细胞粘附效率。CCK-8试剂盒评价MSNCD3、MSNcon对大鼠T淋巴细胞的毒性。混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction, MLR)过程中，利用ELISA和CCK-8分析FK506-MSNCD3、FK506-MSNcon、FK506对IFN-γ、IL-2的分泌和细胞增殖的影响。
结果
⑴磁珠分选试剂盒分离提纯细胞，流式细胞仪检测T淋巴细胞纯度为96.07±1.89%。
⑵CLSM结果显示，T淋巴细胞表面有大量DiI-MSNCD3粘附，而未见DiI-MSNcon粘附。流式细胞学定量结果显示，DiI-MSNCD3、DiI-MSNcon与T淋巴细胞的粘附效率分别为82.3±0.8%、24.6±0.7%，两者具有统计学差异(P＜0.05)。
⑶CCK-8结果表明，T淋巴细胞与不同浓度的MSNCD3和MSNcon孵育6h、12h、24h后，细胞活性未受明显影响。
⑷CCK-8检测，MLR中淋巴细胞与FK506、FK506-MSNcon、FK506-MSNCD3三组作用后，细胞活性分别为48±16%、44±4.0%、27±7.0%。FK506-MSNCD3组细胞活性与FK506-MSNcon、FK506两组细胞增值率相比具有统计学差异(P＜0.05)。
⑸体外细胞因子分泌结果表明，FK506、FK506-MSNcon、FK506-MSNCD3三组细胞培养液上清中，IL-2含量依次分别为858.73±46.52pg/mL、831.53±82.22pg/mL、597.75±65.56pg/mL；IFN-γ含量依次分别为1231.27±79.69pg/mL、1345.96±85.80pg/mL、957.27±92.98pg/mL。FK506-MSNCD3组IL-2和IFN-γ的含量与FK506-MSNcon、FK506两组的含量相比具有统计学差异(P＜0.05)。
结论
携CD3抗体的MSNs可高效结合T淋巴细胞，对细胞活性无明显影响。FK506-MSNCD3通过特异性粘附T淋巴细胞，靶向抑制T细胞的增殖与炎性因子分泌。
第一部分靶向载药介孔硅纳米粒的制备及其表征分析
目的
制备携CD3抗体载FK506的介孔硅纳米粒，对其理化特性进行分析评价。
方法
采用模板合成法制备介孔硅纳米粒(mesoporous silica nanoparticles , MSNs)。利用有机溶剂挥干法将FK506装载于MSNs内。将生物素化磷脂与MSNs共孵育，利用脂质体融合原理，制备磷脂包被的MSNs。通过生物素-亲和素-生物素连接法，将生物素化CD3抗体和同型对照抗体连接到磷脂包被的MSNs表面，制备携CD3抗体或同型对照抗体的载药介孔硅纳米粒(FK506-MSNCD3、FK506-MSNcon)。使用DLS、SEM、TEM及比表面积孔径分析仪评价纳米材料的粒径、电位、稳定性、形态和孔径。流式细胞仪和荧光显微镜检测MSNs磷脂包被和抗体的连接。使用高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)和热差重分析(Thermo Gravimetric Analyzer,TGA)评估载药率和包封率，透析法分析体外药物释放。
结果
⑴通过模板法成功合成了MSNs，并成功制备出FK506-MSNCD3、FK506-MSNcon。DLS显示FK506-MSNCD3、FK506-MSNcon平均粒径分别为327.30±7.60nm、322.70±6.00nm。两者在粒径、电位及PDI等方面未见明显差异。SEM和TEM观察FK506-MSNs呈圆球状，分布均匀，大小均一，无明显聚集现象。
⑵流式细胞学检测显示超过85%MSNs成功包裹生物素化磷脂膜。
⑶DiI-MSNCD3与FITC标记的荧光二抗孵育后，荧光显微镜下可见大量的绿色荧光，且与标记MSNs的DiI红色荧光共定位。
⑷比表面积及孔径分析仪检测，单纯MSNs的比表面积、总孔体积、孔径分别为777.64m2/g、0.94cm3/g、3.0nm。载药之后，FK506-MSNs的比表面积、总孔体积、孔径分别减小至570.70m2/g、0.49cm3/g、2.5nm。
⑸TGA检测MSNs、FK506-MSNs、FK506-MSNCD3三组从0℃升温到800℃的过程中，失重所占百分比分别为14%、78%、86%，计算出FK506-MSNCD3的载药率和包封率分别约为76.83%、68%。
⑹HPLC检测FK506-MSNCD3载药率和包封率分别为75.86±0.65%、63.25±2.85%，与TGA所得的结果相近。体外药物释放实验显示，FK506-MSNCD3与FK506-MSNcon体外释放过程相似，约72h时达到平台期，药物累积释放率各为58.07±6.86%、56.21±3.50%，两者无统计学差异(P＞0.05)。
结论
本研究成功制备了靶向载药纳米体系(FK506-MSNCD3)，粒径均一且具备良好稳定性，体外能缓慢释放其负载的药物。
第二部分纳米粒体外粘附及对T淋巴细胞功能抑制实验
目的
评价靶向载药介孔硅纳米粒与T淋巴细胞的粘附能力，及其对T淋巴细胞增殖和炎性因子分泌的抑制作用。
方法
使用阴选磁珠试剂盒分离提纯大鼠T淋巴细胞，流式细胞仪检测T淋巴细胞纯度。CLSM观察DiI-MSNCD3和DiI-MSNcon与T淋巴细胞的粘附，流式细胞检测仪定量评估DiI-MSNCD3、DiI-MSNcon与T淋巴细胞粘附效率。CCK-8试剂盒评价MSNCD3、MSNcon对大鼠T淋巴细胞的毒性。混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction, MLR)过程中，利用ELISA和CCK-8分析FK506-MSNCD3、FK506-MSNcon、FK506对IFN-γ、IL-2的分泌和细胞增殖的影响。
结果
⑴磁珠分选试剂盒分离提纯细胞，流式细胞仪检测T淋巴细胞纯度为96.07±1.89%。
⑵CLSM结果显示，T淋巴细胞表面有大量DiI-MSNCD3粘附，而未见DiI-MSNcon粘附。流式细胞学定量结果显示，DiI-MSNCD3、DiI-MSNcon与T淋巴细胞的粘附效率分别为82.3±0.8%、24.6±0.7%，两者具有统计学差异(P＜0.05)。
⑶CCK-8结果表明，T淋巴细胞与不同浓度的MSNCD3和MSNcon孵育6h、12h、24h后，细胞活性未受明显影响。
⑷CCK-8检测，MLR中淋巴细胞与FK506、FK506-MSNcon、FK506-MSNCD3三组作用后，细胞活性分别为48±16%、44±4.0%、27±7.0%。FK506-MSNCD3组细胞活性与FK506-MSNcon、FK506两组细胞增值率相比具有统计学差异(P＜0.05)。
⑸体外细胞因子分泌结果表明，FK506、FK506-MSNcon、FK506-MSNCD3三组细胞培养液上清中，IL-2含量依次分别为858.73±46.52pg/mL、831.53±82.22pg/mL、597.75±65.56pg/mL；IFN-γ含量依次分别为1231.27±79.69pg/mL、1345.96±85.80pg/mL、957.27±92.98pg/mL。FK506-MSNCD3组IL-2和IFN-γ的含量与FK506-MSNcon、FK506两组的含量相比具有统计学差异(P＜0.05)。
结论
携CD3抗体的MSNs可高效结合T淋巴细胞，对细胞活性无明显影响。FK506-MSNCD3通过特异性粘附T淋巴细胞，靶向抑制T细胞的增殖与炎性因子分泌。