论文部分内容阅读
在世界范围内，结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)属高发病率的消化系统恶性肿瘤疾病。近些年，随着诊断手段、手术方式以及辅助治疗等方面的不断进步，CRC治疗效果及预后均有所改善，但新发转移性肿瘤患者的比例依然较高，即便施以根治手术与化疗，中晚期患者预后仍然欠理想。为深入理解癌症发生机制及其演变进程，寻找到更加有效的治疗手段，特异性的基因标志物成为近年来的研究热点。
IsochorismataseDomain-Containing1(ISOC1)为可编码蛋白基因，属Isochorismatase水解酶家族基因。ISOC1与其催化过程最初在植物和微生物中被发现，近年来，在一些哺乳动物以及人类细胞中也发现了ISOC1或其同源类似物。动物研究发现，ISOC1与感染、器官功能衰竭、发育畸形等相关；而在人类研究中，ISOC1基因则发现与人阿尔茨海默病、中性粒细胞成熟以及子宫肌瘤发病有关。曾有研究发现，ISOC1在乳腺癌标本中高表达，提示与肿瘤的发病有关，但结直肠癌中的表达以及作用目前国内外均未见报道。本研究通过对临床结肠癌标本分析，细胞培养以及动物模型等系列研究，应用实时荧光定量聚合酶链式反应PCR(qRT-PCR)、免疫组化、流式细胞术、Westernblot、细胞免疫荧光实验等方法，系统研究了ISOC1在结肠癌发病中的表达、作用及其机制。
第一部分ISOC1在结肠癌组织中的表达及其与临床病理特征的相关性
目的：检测ISOC1在结肠癌及其癌旁非癌组织中的表达水平，并探讨ISOC1表达与患者临床病理参数的相关性。
方法：
1.收集106例结肠癌患者癌组织和相配对的癌旁非癌组织标本，运用qRT-PCR法来检测结肠癌以及癌旁非癌结肠组织中ISOC1基因在mRNA水平的表达。
2.免疫组化法检测ISOC1蛋白在38例结肠癌组织和配对癌旁非癌组织中的表达部位以及表达水平。
3.通过t检验、非参数秩和检验以及卡方检验进行统计学处理，明确ISOC1的表达水平与结肠癌患者临床病理参数的相关性。
4.通过随访患者复发及转移情况，用Kaplan-Meier法评估患者2年无疾病进展生存期(DFS)。
5.运用qRT-PCR及WesternBlot方法，检测五种不同结肠癌细胞株和人正常结肠上皮细胞NCM-460细胞株中ISOC1在mRNA以及蛋白质水平的基线表达。
结果：
1.qRT-PCR检测ISOC1在mRNA水平的相对表达，结果显示：与癌旁非癌组织相比，结肠癌患者的癌组织中ISOC1表达明显升高，结果有统计学差异(P＜0.05)。
2.免疫组化方法检测ISOC1在蛋白水平的表达，与配对的癌旁非癌组织标本相比，结肠癌组织ISOC1阳性表达率明显升高(P＜0.05)。
3.统计分析ISOC1的mRNA表达水平与结肠癌患者各临床病理参数之间的关系，结果显示：结肠癌癌组织中，ISOC1的mRNA表达水平与肿瘤大小、浸润程度、局部淋巴结转移、TNM分期有明显的相关性(P＜0.05)，而与患者的性别、年龄、组织学分级、脉管瘤栓等因素无明显相关性(P＞0.05)。
4.统计分析随访数据，结果显示：ISOC1表达增高组与结肠癌患者的不良预后正相关，差异具有显著性(P＜0.05)。
5.用qRT-PCR与Westernblot方法检测不同结肠癌细胞株中ISOC1的表达，结果显示，除RKO外，与人正常结肠上皮细胞NCM-460相比，ISOC1在HCT-116、SW-480、DLD1和HT-29细胞株中表达均明显升高(P均＜0.05)。选择表达较高的HCT-116与SW-480作后续研究对象。
小结：
1.与癌旁非癌组织相比，结肠癌组织中ISOC1基因在mRNA及蛋白表达水平上调。
2.ISOC1表达水平与结肠癌患者肿瘤大小、TNM分期、肿瘤侵润深度和局部淋巴结转移明显相关。
3.ISOC1高表达与结肠癌患者的不良预后相关。
4.与人正常结肠上皮细胞NCM-460相比，4株结肠癌细胞中ISOC1的mRNA与蛋白水平均表达增加。选定ISOC1表达较高的HCT-116与SW-480细胞株用于进一步的ISOC1抑制研究。
第二部分下调ISOC1表达对结肠癌细胞生物学功能的影响
目的：研究下调ISOC1表达对人结肠癌胞株增殖、凋亡以及迁移能力的影响。
方法：
1.以慢病毒为载体，构建含绿色荧光蛋白的两种不同干扰序列的小发卡样干扰RNA(shRNA)，侵染目的细胞并检测ISOC1干扰效率。
2.利用MTS实验和平板克隆形成实验检测肿瘤细胞的增殖和克隆能力。
3.检测Caspase3/7活性、行流式细胞凋亡实验评估肿瘤细胞凋亡。Westernblot检测凋亡相关蛋白的表达。
4.应用划痕实验及Transwell实验来检测肿瘤细胞的迁移能力。
结果：
1.荧光显微镜下观察到细胞感染病毒阳性率均达到80%以上。qRT-PCR以及Westernblot检测感染慢病毒的HCT-116和SW-480细胞中ISOC1表达，结果显示，与感染非特异性阴性对照序列(shCtrl)的细胞相比，感染干扰序列(shISOC1-1和shISOC1-2)的细胞中ISOC1的mRNA以及蛋白的表达水平均明显降低(约75%)。说明以慢病毒为载体的shRNA成功感染并干扰了ISOC1在HCT-116和SW-480细胞株中的的表达。
2.MTS实验中在0、1、2、3、4天对OD值进行检测，计算两种细胞株的活力，计算结果为所测OD值与第0天OD值的比值(OD492/flod)。结果显示：下调ISOC1表达可明显抑制HCT-116和SW-480两种细胞株增殖能力(P＜0.05)。克隆实验结果显示，与shCtrl组细胞相比，shISOC1-1和shISOC1-2组细胞的克隆能力明显受到抑制(P＜0.05)。
3.凋亡相关研究发现，与shCtrl组相比，shISOC1-1和ISOC1-2组细胞中caspase3/7活性明显增加(P＜0.05)，细胞凋亡明显增加(P＜0.05)。细胞凋亡相关基因cleaved-PARP1、cleaved-caspase-3和-9的蛋白表达水平显著增加(P＜0.05)，而cleaved-caspase-8无明显差异(P＞0.05)。
4.划痕实验以及Transwel实验结果显示，与shCtrl组相比，shISOC1-1和shISOC1-2组细胞划痕愈合能力明显受到抑制：(P＜0.05)，穿透膜的细胞数量明显减少(P＜0.05)，说明ISOC1沉默后能明显抑制人结肠癌细胞株HCT-116和SW-480细胞迁移能力。
小结：
1.转染含有shISOC1的慢病毒可有效抑制HCT-116和SW-480结肠癌细胞株中ISOC1的表达。
2.下调ISOC1可明显抑制结肠癌细胞HCT-116和SW-480的增殖能力。
3.ISOC1表达被抑制可明显促进HCT-116和SW-480结肠癌细胞的凋亡，激活线粒体凋亡途径相关。
4.下调ISOC1表达可明显抑制HCT-116和SW-480结肠癌细胞的迁移能力。
第三部分下调ISOC1表达对结肠癌细胞生物学功能影响的机制研究
目的：检测在人结肠癌细胞中抑制ISOC1表达后，关键信号通路蛋白的表达变化，探索下调ISOC1影响结肠癌细胞生物学功能的机制。
方法：
1.应用慢病毒感染并构建稳定沉默ISOC1基因的结肠癌细胞株，应用Pathscan试剂盒在HCT-116细胞中筛选下调ISOC1后表达明显改变的关键通路蛋白。
2.应用Westernblot在HCT-116和SW-480细胞中验证Pathscan结果。在下调ISOC1表达的细胞中应用UCN01抑制AKT蛋白磷酸化位点Thr308，检测AKT/GSK-3β通路中重要蛋白的表达变化，并以DMSO溶液作为对照。
3.应用MTS实验、流式细胞凋亡实验和Transwell实验验证沉默ISOC1基因通过AKT/GSK-3β通路影响结肠癌细胞的生物学功能。
4.应用质粒下调和过表达AKT蛋白磷酸化位点Thr308，WesternBlot进一步验证AKT/GSK-3β通路，并检测ISOC1沉默对细胞中起增殖和迁移关键作用的下游蛋白的影响。
5.用细胞免疫荧光实验与Westenblot实验检测下调ISOC1后HCT-116和SW-480细胞核与细胞质中具有肿瘤抑制作用的转录激活因子p-STAT1Tyr701蛋白表达水平。
结果：
1.Pathscan结果显示：在结肠癌细胞HCT-116中抑制ISOC1后cleaved–PARP、Caspase-3、p-AKTThr308、p-GSK-3βSer9、p-STAT1Tyr701级p-AMPKαThr172的表达均明显增加(P＜0.05)，p-AKTSer473表达变化无统计学意义(P＞0.05)。
2.应用Westernblot选择验证Pathscan结果，相较于对照组，ISOC1下调组细胞中的p-AKTThr308、p-GSK-3βSer9和p-STAT1Tyr701蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)。在下调ISOC1的表达的结肠癌细胞中，通路蛋白抑制剂UCN01可以抑制p-GSK-3βSer9的表达(P＜0.05)。
3.MTS实验结果显示：应用相对小剂量的UCN01可以逆转ISOC1沉默导致的结肠癌细胞HCT-116和SW-480的增殖能力的抑制(P＜0.05)。
4.流式细胞凋亡实验结果显示：下调ISOC1表达后对HCT-116和SW-480凋亡的影响可被应用UCN01后逆转(P＜0.05)。
5.Transwell实验结果显示：UCN01可逆转由下调ISOC1导致的HCT-116和SW-480细胞迁移能力的抑制(P＜0.05)。
6.Westernblot结果显示：与应用干扰质粒(AKTΔ-Thr308)下调p-AKTThr308的细胞相比，应用质粒(AKTP-Thr308 )过表达p-AKTThr308的细胞p-GSK-3βSer9在蛋白水平表达明显升高(P＜0.05)。
7.Westernblot结果显示：在HCT-116和SW-480细胞中，下调ISOC1表达后可明显减少c-Myc,MMP2andMMP9的表达。
8.细胞免疫荧光实验与Westenblot结果显示：与对照组相比，抑制ISOC1表达可导致HCT-116和SW-480细胞核中p-STAT1Tyr701蛋白水平明显升高，而细胞质中则表达减低。
小结：
1.抑制ISOC1表达可导致结肠癌细胞HCT-116和SW-480中的p-AKTThr308、p-GSK-3βSer9和p-STAT1Tyr701蛋白表达升高。
2.下调ISOC1可通过AKT／GSK-3β通路影响结肠癌细胞的生物学功能。
3.进一步研究发现，ISOC1的下调可能是部分激活了AKT／GSK-3β通路，ISOC1下调后在结肠癌细胞中可减少增殖与迁移相关蛋白的表达。
4.下调ISOC1可以促进HCT-116和SW-480结肠癌细胞p-STAT1Tyr701由细胞质向细胞核转位。
第四部分下调ISOC1表达对人结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长影响的研究
目的：为进一步了解和探索ISOC1沉默对体内结肠癌的影响。研究ISOC1基因沉默对裸鼠体内HCT-116细胞移植瘤的影响。探索其未来作为治疗靶点的潜力。
方法：
1.应用慢病毒感染并构建稳定沉默ISOC1的结肠癌细胞株和阴性对照细胞株。将购买的裸鼠随机分为shISOC1以及shCtrl组(n=5/组)，皮下注射含有shISOC1或shCtrl的慢病毒感染的HCT-116细胞，观察21天后小鼠处死，测量肿瘤大小，统计数据。
2.运用免疫组化技术检测两组小鼠移植瘤ISOC1蛋白表达情况。
结果：
1.绘制肿瘤生长曲线，统计结果。与shCtrl组相比，shISOC1组肿瘤的生长明显受到抑制，表现为观察末的肿瘤的体积(shCtrl718.469±279.618mm3vs.shISOC1154.193±79.492mm3,P＜0.05)与重量(shCtrl0.685±0.274gvs.shISOC10.143±0.675g，P＜0.05)均明显减少。
2.免疫组化观察移植瘤组织ISOC1蛋白表达情况，结果显示，与shCtrl组相比，shISOC1组ISOC1蛋白表达明显降低(P＜0.05)。通过本研究表明下调ISOC1表达后可以对小鼠体内人结肠癌细胞移植瘤的生长有明显的抑制作用。
小结：
1.接种慢病毒感染的的HCT-116细胞至裸鼠皮下，可成功建立移植瘤模型。
2.下调ISOC1表达可明显抑制裸鼠皮下移植瘤生长，免疫组化显示ISOC1在两组移植瘤组织中表达差异。
结论：
1.与癌旁非癌组织相比，ISOC1在结肠癌组织中表达明显升高，且与患者肿瘤的大小、浸润程度、TNM分期和局部淋巴结转移明显相关；ISOC1高表达与结肠癌患者不良预后相关。HCT-116与SW-480细胞株中ISOC1表达明显高于NCM460。
2.体外干扰ISOC1表达可抑制HCT-116和SW-480细胞的增殖、迁移能力，并可能通过线粒体途径促进凋亡。
3.下调ISOC1抑制肿瘤细胞增殖及迁移与激活AKT/GSK-3β信号通路有关。
4.在结肠癌细胞中下调ISOC1可促进P-STAT-1由细胞质向细胞核转位。
5.干扰ISOC1表达可显著抑制人结肠癌细胞株裸鼠皮下移植瘤的增殖。
IsochorismataseDomain-Containing1(ISOC1)为可编码蛋白基因，属Isochorismatase水解酶家族基因。ISOC1与其催化过程最初在植物和微生物中被发现，近年来，在一些哺乳动物以及人类细胞中也发现了ISOC1或其同源类似物。动物研究发现，ISOC1与感染、器官功能衰竭、发育畸形等相关；而在人类研究中，ISOC1基因则发现与人阿尔茨海默病、中性粒细胞成熟以及子宫肌瘤发病有关。曾有研究发现，ISOC1在乳腺癌标本中高表达，提示与肿瘤的发病有关，但结直肠癌中的表达以及作用目前国内外均未见报道。本研究通过对临床结肠癌标本分析，细胞培养以及动物模型等系列研究，应用实时荧光定量聚合酶链式反应PCR(qRT-PCR)、免疫组化、流式细胞术、Westernblot、细胞免疫荧光实验等方法，系统研究了ISOC1在结肠癌发病中的表达、作用及其机制。
第一部分ISOC1在结肠癌组织中的表达及其与临床病理特征的相关性
目的：检测ISOC1在结肠癌及其癌旁非癌组织中的表达水平，并探讨ISOC1表达与患者临床病理参数的相关性。
方法：
1.收集106例结肠癌患者癌组织和相配对的癌旁非癌组织标本，运用qRT-PCR法来检测结肠癌以及癌旁非癌结肠组织中ISOC1基因在mRNA水平的表达。
2.免疫组化法检测ISOC1蛋白在38例结肠癌组织和配对癌旁非癌组织中的表达部位以及表达水平。
3.通过t检验、非参数秩和检验以及卡方检验进行统计学处理，明确ISOC1的表达水平与结肠癌患者临床病理参数的相关性。
4.通过随访患者复发及转移情况，用Kaplan-Meier法评估患者2年无疾病进展生存期(DFS)。
5.运用qRT-PCR及WesternBlot方法，检测五种不同结肠癌细胞株和人正常结肠上皮细胞NCM-460细胞株中ISOC1在mRNA以及蛋白质水平的基线表达。
结果：
1.qRT-PCR检测ISOC1在mRNA水平的相对表达，结果显示：与癌旁非癌组织相比，结肠癌患者的癌组织中ISOC1表达明显升高，结果有统计学差异(P＜0.05)。
2.免疫组化方法检测ISOC1在蛋白水平的表达，与配对的癌旁非癌组织标本相比，结肠癌组织ISOC1阳性表达率明显升高(P＜0.05)。
3.统计分析ISOC1的mRNA表达水平与结肠癌患者各临床病理参数之间的关系，结果显示：结肠癌癌组织中，ISOC1的mRNA表达水平与肿瘤大小、浸润程度、局部淋巴结转移、TNM分期有明显的相关性(P＜0.05)，而与患者的性别、年龄、组织学分级、脉管瘤栓等因素无明显相关性(P＞0.05)。
4.统计分析随访数据，结果显示：ISOC1表达增高组与结肠癌患者的不良预后正相关，差异具有显著性(P＜0.05)。
5.用qRT-PCR与Westernblot方法检测不同结肠癌细胞株中ISOC1的表达，结果显示，除RKO外，与人正常结肠上皮细胞NCM-460相比，ISOC1在HCT-116、SW-480、DLD1和HT-29细胞株中表达均明显升高(P均＜0.05)。选择表达较高的HCT-116与SW-480作后续研究对象。
小结：
1.与癌旁非癌组织相比，结肠癌组织中ISOC1基因在mRNA及蛋白表达水平上调。
2.ISOC1表达水平与结肠癌患者肿瘤大小、TNM分期、肿瘤侵润深度和局部淋巴结转移明显相关。
3.ISOC1高表达与结肠癌患者的不良预后相关。
4.与人正常结肠上皮细胞NCM-460相比，4株结肠癌细胞中ISOC1的mRNA与蛋白水平均表达增加。选定ISOC1表达较高的HCT-116与SW-480细胞株用于进一步的ISOC1抑制研究。
第二部分下调ISOC1表达对结肠癌细胞生物学功能的影响
目的：研究下调ISOC1表达对人结肠癌胞株增殖、凋亡以及迁移能力的影响。
方法：
1.以慢病毒为载体，构建含绿色荧光蛋白的两种不同干扰序列的小发卡样干扰RNA(shRNA)，侵染目的细胞并检测ISOC1干扰效率。
2.利用MTS实验和平板克隆形成实验检测肿瘤细胞的增殖和克隆能力。
3.检测Caspase3/7活性、行流式细胞凋亡实验评估肿瘤细胞凋亡。Westernblot检测凋亡相关蛋白的表达。
4.应用划痕实验及Transwell实验来检测肿瘤细胞的迁移能力。
结果：
1.荧光显微镜下观察到细胞感染病毒阳性率均达到80%以上。qRT-PCR以及Westernblot检测感染慢病毒的HCT-116和SW-480细胞中ISOC1表达，结果显示，与感染非特异性阴性对照序列(shCtrl)的细胞相比，感染干扰序列(shISOC1-1和shISOC1-2)的细胞中ISOC1的mRNA以及蛋白的表达水平均明显降低(约75%)。说明以慢病毒为载体的shRNA成功感染并干扰了ISOC1在HCT-116和SW-480细胞株中的的表达。
2.MTS实验中在0、1、2、3、4天对OD值进行检测，计算两种细胞株的活力，计算结果为所测OD值与第0天OD值的比值(OD492/flod)。结果显示：下调ISOC1表达可明显抑制HCT-116和SW-480两种细胞株增殖能力(P＜0.05)。克隆实验结果显示，与shCtrl组细胞相比，shISOC1-1和shISOC1-2组细胞的克隆能力明显受到抑制(P＜0.05)。
3.凋亡相关研究发现，与shCtrl组相比，shISOC1-1和ISOC1-2组细胞中caspase3/7活性明显增加(P＜0.05)，细胞凋亡明显增加(P＜0.05)。细胞凋亡相关基因cleaved-PARP1、cleaved-caspase-3和-9的蛋白表达水平显著增加(P＜0.05)，而cleaved-caspase-8无明显差异(P＞0.05)。
4.划痕实验以及Transwel实验结果显示，与shCtrl组相比，shISOC1-1和shISOC1-2组细胞划痕愈合能力明显受到抑制：(P＜0.05)，穿透膜的细胞数量明显减少(P＜0.05)，说明ISOC1沉默后能明显抑制人结肠癌细胞株HCT-116和SW-480细胞迁移能力。
小结：
1.转染含有shISOC1的慢病毒可有效抑制HCT-116和SW-480结肠癌细胞株中ISOC1的表达。
2.下调ISOC1可明显抑制结肠癌细胞HCT-116和SW-480的增殖能力。
3.ISOC1表达被抑制可明显促进HCT-116和SW-480结肠癌细胞的凋亡，激活线粒体凋亡途径相关。
4.下调ISOC1表达可明显抑制HCT-116和SW-480结肠癌细胞的迁移能力。
第三部分下调ISOC1表达对结肠癌细胞生物学功能影响的机制研究
目的：检测在人结肠癌细胞中抑制ISOC1表达后，关键信号通路蛋白的表达变化，探索下调ISOC1影响结肠癌细胞生物学功能的机制。
方法：
1.应用慢病毒感染并构建稳定沉默ISOC1基因的结肠癌细胞株，应用Pathscan试剂盒在HCT-116细胞中筛选下调ISOC1后表达明显改变的关键通路蛋白。
2.应用Westernblot在HCT-116和SW-480细胞中验证Pathscan结果。在下调ISOC1表达的细胞中应用UCN01抑制AKT蛋白磷酸化位点Thr308，检测AKT/GSK-3β通路中重要蛋白的表达变化，并以DMSO溶液作为对照。
3.应用MTS实验、流式细胞凋亡实验和Transwell实验验证沉默ISOC1基因通过AKT/GSK-3β通路影响结肠癌细胞的生物学功能。
4.应用质粒下调和过表达AKT蛋白磷酸化位点Thr308，WesternBlot进一步验证AKT/GSK-3β通路，并检测ISOC1沉默对细胞中起增殖和迁移关键作用的下游蛋白的影响。
5.用细胞免疫荧光实验与Westenblot实验检测下调ISOC1后HCT-116和SW-480细胞核与细胞质中具有肿瘤抑制作用的转录激活因子p-STAT1Tyr701蛋白表达水平。
结果：
1.Pathscan结果显示：在结肠癌细胞HCT-116中抑制ISOC1后cleaved–PARP、Caspase-3、p-AKTThr308、p-GSK-3βSer9、p-STAT1Tyr701级p-AMPKαThr172的表达均明显增加(P＜0.05)，p-AKTSer473表达变化无统计学意义(P＞0.05)。
2.应用Westernblot选择验证Pathscan结果，相较于对照组，ISOC1下调组细胞中的p-AKTThr308、p-GSK-3βSer9和p-STAT1Tyr701蛋白表达水平明显升高(P＜0.05)。在下调ISOC1的表达的结肠癌细胞中，通路蛋白抑制剂UCN01可以抑制p-GSK-3βSer9的表达(P＜0.05)。
3.MTS实验结果显示：应用相对小剂量的UCN01可以逆转ISOC1沉默导致的结肠癌细胞HCT-116和SW-480的增殖能力的抑制(P＜0.05)。
4.流式细胞凋亡实验结果显示：下调ISOC1表达后对HCT-116和SW-480凋亡的影响可被应用UCN01后逆转(P＜0.05)。
5.Transwell实验结果显示：UCN01可逆转由下调ISOC1导致的HCT-116和SW-480细胞迁移能力的抑制(P＜0.05)。
6.Westernblot结果显示：与应用干扰质粒(AKTΔ-Thr308)下调p-AKTThr308的细胞相比，应用质粒(AKTP-Thr308 )过表达p-AKTThr308的细胞p-GSK-3βSer9在蛋白水平表达明显升高(P＜0.05)。
7.Westernblot结果显示：在HCT-116和SW-480细胞中，下调ISOC1表达后可明显减少c-Myc,MMP2andMMP9的表达。
8.细胞免疫荧光实验与Westenblot结果显示：与对照组相比，抑制ISOC1表达可导致HCT-116和SW-480细胞核中p-STAT1Tyr701蛋白水平明显升高，而细胞质中则表达减低。
小结：
1.抑制ISOC1表达可导致结肠癌细胞HCT-116和SW-480中的p-AKTThr308、p-GSK-3βSer9和p-STAT1Tyr701蛋白表达升高。
2.下调ISOC1可通过AKT／GSK-3β通路影响结肠癌细胞的生物学功能。
3.进一步研究发现，ISOC1的下调可能是部分激活了AKT／GSK-3β通路，ISOC1下调后在结肠癌细胞中可减少增殖与迁移相关蛋白的表达。
4.下调ISOC1可以促进HCT-116和SW-480结肠癌细胞p-STAT1Tyr701由细胞质向细胞核转位。
第四部分下调ISOC1表达对人结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长影响的研究
目的：为进一步了解和探索ISOC1沉默对体内结肠癌的影响。研究ISOC1基因沉默对裸鼠体内HCT-116细胞移植瘤的影响。探索其未来作为治疗靶点的潜力。
方法：
1.应用慢病毒感染并构建稳定沉默ISOC1的结肠癌细胞株和阴性对照细胞株。将购买的裸鼠随机分为shISOC1以及shCtrl组(n=5/组)，皮下注射含有shISOC1或shCtrl的慢病毒感染的HCT-116细胞，观察21天后小鼠处死，测量肿瘤大小，统计数据。
2.运用免疫组化技术检测两组小鼠移植瘤ISOC1蛋白表达情况。
结果：
1.绘制肿瘤生长曲线，统计结果。与shCtrl组相比，shISOC1组肿瘤的生长明显受到抑制，表现为观察末的肿瘤的体积(shCtrl718.469±279.618mm3vs.shISOC1154.193±79.492mm3,P＜0.05)与重量(shCtrl0.685±0.274gvs.shISOC10.143±0.675g，P＜0.05)均明显减少。
2.免疫组化观察移植瘤组织ISOC1蛋白表达情况，结果显示，与shCtrl组相比，shISOC1组ISOC1蛋白表达明显降低(P＜0.05)。通过本研究表明下调ISOC1表达后可以对小鼠体内人结肠癌细胞移植瘤的生长有明显的抑制作用。
小结：
1.接种慢病毒感染的的HCT-116细胞至裸鼠皮下，可成功建立移植瘤模型。
2.下调ISOC1表达可明显抑制裸鼠皮下移植瘤生长，免疫组化显示ISOC1在两组移植瘤组织中表达差异。
结论：
1.与癌旁非癌组织相比，ISOC1在结肠癌组织中表达明显升高，且与患者肿瘤的大小、浸润程度、TNM分期和局部淋巴结转移明显相关；ISOC1高表达与结肠癌患者不良预后相关。HCT-116与SW-480细胞株中ISOC1表达明显高于NCM460。
2.体外干扰ISOC1表达可抑制HCT-116和SW-480细胞的增殖、迁移能力，并可能通过线粒体途径促进凋亡。
3.下调ISOC1抑制肿瘤细胞增殖及迁移与激活AKT/GSK-3β信号通路有关。
4.在结肠癌细胞中下调ISOC1可促进P-STAT-1由细胞质向细胞核转位。
5.干扰ISOC1表达可显著抑制人结肠癌细胞株裸鼠皮下移植瘤的增殖。