肌内脂肪（intramuscular fat,IMF）是衡量猪肉嫩度和风味的关键指标。随着人们对高档猪肉的追求,如何提高猪肉中IMF含量成为猪肉品质研究的热门话题之一。莱芜猪是我国脂肪型猪的典型代表,IMF含量高。但在猪肉生产中发现,在相同生长环境下,莱芜猪个体间IMF含量差异较大。这可能是由于不同个体间某些基因差异表达引起的。本课题基于IMF含量表型差异显著的8头莱芜猪的全转录组测序结果,筛选出与IMF沉积相关的mi R-34a/LEF1关系网络,并开展mi R-34a/LEF1在脂质沉积及IMF沉积过程中的功能及机制研究。1莱芜猪个体间IMF沉积能力差异的研究本研究旨在通过检测莱芜猪背最长肌IMF含量及其亲缘关系,确定测序样品。样品分为背最长肌IMF含量较高组（IMF＞12%,H组）和IMF含量较低组（IMF＜5%,L组）。结果如下:（1）共检测29头莱芜猪背最长肌IMF含量,其含量在2.17%～13.93%之间。（2）根据IMF含量以及亲缘关系,筛选出8头猪的背最长肌样品用于全转录组测序。所筛选样本IMF含量如下:H组为12.45%、13.93%、13.27%和13.38%;L组为4.23%、4.29%、4.31%和3.23%;依次对应为半同胞关系。t检验发现H组IMF含量极显著高于L组（P＜0.001）。油红O染色证实H组莱芜猪的肝脏及背最长肌横断面脂肪沉积面积均高于L组。2全转录组测序挖掘不同IMF含量的莱芜猪基因表达谱对确定的H和L组莱芜猪背最长肌样品进行全转录组测序,以|fold change|＞1和Padj＜0.05作为差异基因的筛选标准。（1）测序共获得17个差异表达的lnc RNAs。GO和KEGG功能分析结果显示,差异lnc RNAs主要富集于脂肪酸的生物合成、脂肪酸代谢、脂肪细胞分化以及脂肪酸结合分子等功能,并且显著富集到脂肪酸延伸（P=0.015）和花生四烯酸代谢（P=0.019）两条信号通路。此外,获得差异circ RNAs 14个,功能分析未显示富集到与IMF沉积相关内容。（2）获得差异表达m RNAs共180个。GO功能分析发现,差异m RNAs显著富集到细胞对脂肪酸的反应、胰岛素受体识别和甘油激酶活性调控等功能。KEGG富集分析显示,与脂肪沉积和脂质代谢相关的通路包括m TOR、TGF-β、AMPK、Wnt、PI3K-Akt、MAPK及胰岛素调节信号通路。（3）mi RNA测序发现24个差异mi RNAs。GO和KEGG功能分析显示,差异mi RNAs主要富集在脂质代谢、合成及细胞对脂质应答等过程,并参与调控Wnt、Hedgehog、m TOR、AMPK、MAPK、PI3K-Akt、PPAR及胰岛素信号通路。（4）差异表达lnc RNAs和m RNAs联合分析结果发现lnc RNAs共靶向7个m RNAs（上调2个、下调5个）。mi RNAs与m RNAs联合分析获得三组靶向关系:mi R-532-HMCES/PLD3、mi R-34a-LEF1及mi R-6782-3PDDX54/ARHGEF7/JARIC2。mi RNAs/m RNAs富集到与肌肉发育和脂肪沉积相关的11条GO项目中（P＜0.05）均包含m RNA LEF1。同时,KEGG结果显示富集到与IMF沉积相关的Wnt信号通路（涉及LEF1）。因此,将mi R-34a/LEF1以及Wnt信号通路作为后续功能研究的主要内容。3 mi R-34a/LEF1在IMF沉积过程中的功能及机制研究本研究以3T3-L1和C2C12细胞为试验对象,通过转染mi R-34a或LEF1以及双荧光素酶试验,确定mi R-34a/LEF1靶向关系并检测其对Wnt信号通路激活、成脂标志基因（PPARγ、C/EBPα、FABP4和Perilipin1）表达及脂质积累的影响。其次,转染mi R-34a后检测油酸钠诱导的C2C12细胞中脂质的积累。第三,检测在3T3-L1和C2C12共培养状态下转染mi R-34a对LEF1及IMF沉积的影响。最后,探索过表达mi R-34a后3T3-L1细胞分化过程中的条件培养基对C2C12细胞脂质沉积的影响。结果如下:（1）mi R-34a和LEF1表达研究发现,两者在背膘和肌肉组织中表达较高。H组LEF1的蛋白表达显著低于L组（P＜0.05）。诱导分化3T3-L1细胞,mi R-34a的表达显著升高（P＜0.05）,而LEF1在诱导分化前期（d 0～d 8）显著降低（P＜0.05）,随后有升高的趋势。原位杂交和免疫荧光检测发现,mi R-34a和LEF1均在细胞质中表达,当3T3-L1细胞分化后LEF1富集到细胞核内。（2）Targetscant和Starbase网站预测发现LEF1与mi R-34a存在靶向关系。双荧光素酶试验结果显示,过表达mi R-34a极显著降低pmir GLO-LEF1-WT报告基因的荧光素酶活性（P＜0.01）,证明两者之间存在靶向关系。（3）mi R-34a在3T3-L1细胞脂质沉积中的功能研究。（1）在3T3-L1细胞分化d 0和d 8,mi R-34a过表达显著促进成脂标志基因的表达,并降低LEF1的表达（P＜0.05）。LEF1及细胞核中β-catenin的蛋白表达显著降低,而PPARγ和C/EBPα的蛋白表达显著升高（P＜0.05）。Bodipy和油红O染色结果显示mi R-34a过表达后脂滴积累高于对照组。此外,mi R-34a表达被干扰后,LEF1与成脂标志基因的表达（m RNA及蛋白水平）呈现相反趋势（P＜0.05）,同时,脂滴沉积面积相应减少。说明mi R-34a靶向LEF1促进脂肪细胞中脂质的沉积。（2）LEF1在3T3-L1细胞脂质沉积中的功能。3T3-L1细胞中过表达LEF1可显著下调PPARγ、C/EBPα、FABP4和Perilipin1的表达,而干扰LEF1的表达后成脂标志基的表达升高（P＜0.05）。说明LEF1抑制脂肪细胞中脂质沉积过程。（3）mi R-34a与LEF1回补试验中,在3T3-L1细胞中同时过表达或沉默mi R-34a或LEF1发现,LEF1及成脂标志基因的表达无显著差异。证实mi R-34a介导LEF1调控脂肪细胞中脂质沉积过程。（4）mi R-34a对油酸钠诱导的C2C12细胞脂滴沉积的调控。C2C12细胞中过表达mi R-34a可显著促进PPARγ、C/EBPα和FABP4的表达,抑制LEF1的表达（P＜0.05）,并促进成肌细胞中脂滴积累。干扰mi R-34a后呈现相反结果。说明mi R-34a介导LEF1促进成肌细胞中脂质的积累。（5）mi R-34a对C2C12和3T3-L1细胞共培养状态中脂质沉积的影响,转染mi R-34a mimics的共培养细胞处理组PPARγ、C/EBPα和FABP4的表达显著升高,LEF1和My OD的表达显著降低,脂质沉积增多（P＜0.05）,而mi R-34a inhibitor则表现出相反功能。表明mi R-34a靶向LEF1可促进共培养状态中脂质的沉积。（6）3T3-L1细胞过表达mi R-34a对C2C12细胞中脂质沉积的影响。3T3-L1细胞过表达mi R-34a后,收集细胞分化d 0～d 8的培养液,用做C2C12细胞的条件培养基。结果显示,3T3-L1分化后期的条件培养基显著抑制LEF1的表达,并促进C2C12细胞中成脂标志基因的表达以及脂滴的积累（P＜0.05）。表明mi R-34a过表达的3T3-L1细胞条件培养基可促进C2C12细胞中脂质的沉积。综上所述,mi R-34a靶向LEF1促进脂肪细胞和成肌细胞中脂质的沉积,调控IMF沉积过程,导致莱芜猪个体间IMF含量的差异。