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研究目的1、探讨不同浓度的重组人促红细胞生成素(rhEPO)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响,并找出成骨效应/剂量比最大的浓度(最适浓度)用于后续实验;2、探讨机械牵拉联合rhEPO对大鼠BMSCs的影响;3、探讨细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)通路在机械牵拉联合rhEPO促进大鼠BMSCs成骨分化过程中的作用。研究方法1、采用全骨髓培养法提取、分离并培养大鼠BMSCs,经流式细胞仪鉴定后,选取第三代(P3)细胞进行本次研究。用含0.5%胎牛血清(FBS)的低糖培养基(L-DMEM)为培养液,以不同浓度5 IU/ml、10 IU/ml、20 IU/ml和40 IU/ml的rhEPO与BMSCs共培养为实验组,以不加rhEPO的BMSCs为对照组,培养7d后,利用CCK-8检测BMSCs的增殖情况,ALP活性法检测BMSCs的成骨分化情况。实验后确定最佳浓度rhEPO(20 IU/ml)用于后续研究。2、同样选取P3细胞,根据处理方式的不同将细胞分成4组,分别为对照组(CON,不做处理)、机械牵拉(STR,牵拉频率为1Hz、应变率为10%、4h/次、2次/d)组、最佳浓度rhEPO(E20)组以及机械牵拉联合最佳浓度rhEPO(STR+E20)组,处理7d后,利用CCK-8检测BMSCs的增殖情况,CFA检测细胞的集落生成情况,流式细胞仪检测BMSCs的细胞周期情况,Transwell实验检测细胞的迁移情况,ALP染色、活性法检测BMSCs的成骨分化情况,qPCR 检测 Ets-1、C-myc、Ccndl、C-fos、ALP、OCN、COL 和 Runx2 的基因表达情况。3、同样选取P3细胞,根据处理方式的不同将细胞分成4组,分别为CON、STR、E20以及STR+E20组,处理7d后,利用Western blot检测ERK1/2和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的表达水平。在阻滞剂实验中,根据处理方式的不同将细胞分成4组,分别为对照组(CON)、STR+E20组、对照阻滞组、STR+E20阻滞组。用成骨诱导培养液来培养细胞,阻滞组中额外用ERK阻滞剂(U0126,10 μM)处理细胞,处理7d后,ALP活性法检测BMSCs的成骨分化情况。研究结果1、P3大鼠BMSCs形态均一、以成纤维细胞样贴壁生长;流式细胞仪鉴定BMSCs免疫表型,结果表明BMSCs高表达CD79和CD90,低表达CD11b和CD45,符合公认的BMSCs免疫表型。2、不同浓度的rhEPO作用于大鼠BMSCs,其CCK-8所测OD值均变大,ALP活性增加,当rhEPO浓度为20 IU/ml时,变化最明显。3、单纯STR、单纯E20和STR+E20作用于大鼠BMSCs,其OD值均变大、集落数增多、迁移数增多、ALP染色变深、ALP活性增加、基因明显上调,并且STR+E20组细胞其各种变化最明显。4、单纯STR、单纯E20和STR+E20作用于大鼠BMSCs,其p-ERK1/2相对表达水平均升高,并且STR+E20组变化最明显。用阻滞剂持续处理细胞,对照阻滞组和STR+E20阻滞组细胞的ALP活性均明显下降。结论1、不同浓度的rhEPO均能促进大鼠BMSCs的增殖和成骨分化,并且rhEPO对细胞的影响具有浓度-反应关系,当浓度为20 IU/ml时对细胞的增殖和成骨分化的效应最明显;因此最佳rhEPO浓度为20 IU/ml。2、机械牵拉联合rhEPO能促进大鼠BMSCs的增殖、迁移和成骨分化。3、ERK1/2通路参与机械牵拉联rhEPO促进大鼠BMSCs成骨分化的过程,且当该通路被阻滞剂阻滞时,上述成骨分化效应明显被减弱。