论文部分内容阅读
大肠杆菌病作为临床上常见的细菌性疾病,给我国养殖业造成的经济损失尤为严重,而黏附过程常被认为是细菌感染的第一步,也是至关重要的一步。根据本实验室K88ac+产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic ETEC)国内参考株 C83902株全基因组测序数据,利用GeneMarkS、fgenesB等软件对基因进行预测的基础上,本研究以Sfm菌毛为突破口,结合基因克隆、构建突变株、表型分析等实验手段对其进行有效的功能鉴定。前期通过BLAST软件与GenBank上不同大肠杆菌全基因组序列比对发现,Sfm菌毛操纵子基因保守且完整地存在于众多大肠杆菌致病菌株中,包括ETEC、禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic APEC)、尿致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC)等。本研究通过对大肠杆菌Sfm菌毛致病性的深入挖掘和探索,有助于进一步研究大肠杆菌与机体相互作用的分子机制,为制定大肠杆菌病的防控策略和研发新型疫苗奠定研究基础。1.大肠杆菌Sfm菌毛操纵子sfm基因的克隆、表达及其生物学活性初步探究本研究通过在体外克隆和表达ETEC K88ac+国内参考株C83902株中Sfm菌毛操纵子的主要结构基因sfmACDHF,旨在检测Sfm菌毛的相关生物学活性。首先以ETEC C83902株基因组DNA为模板,利用长片段PCR技术扩增编码Sfm菌毛的sfm操纵子,然后导入表达载体pBR322中,构建和筛选重组质粒pBR322-sfm,再将鉴定正确的重组质粒转化至不含菌毛结构的大肠杆菌SE5000模式菌,得到重组菌SE5000(pBR322-sfm)。红细胞凝集试验表明该重组菌不能与鸡血红细胞发生凝集。在透射电镜下未观察到菌毛样结构,但用改良后的MME方法制备Sfm菌毛蛋白,经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色鉴定,得到分子量约为35 kDa的清晰蛋白条带,并能被鼠源SfmH亚单位多克隆抗体特异性识别,证明了 Sfm菌毛在重组菌中的成功表达。黏附试验发现Sfm菌毛对鸡成纤维细胞系DF1细胞无显著体外黏附作用(P>0.05)。细胞吞噬试验结果表明,和对照组相比,鸡巨噬细胞系HD-11细胞对表达Sfm菌毛的重组菌吞噬能力下降了 50%(P<0.01)。本研究首次对大肠杆菌Sfm菌毛进行体外克隆、表达和功能探析,为大肠杆菌新毒力因子的发掘和致病机制的阐释奠定理论基础。2.禽致病性大肠杆菌CE129株sfmA基因缺失株的构建及其相关功能性初步探索为进一步探究Sfm菌毛的功能和作用,本研究以禽致病性大肠杆菌CE129菌株为载体,利用λ-Red同源重组技术敲除Sfm菌毛的亚单位基因sfmA,构建缺失株CE1 29△sfmA。首先根据已知的sfmA基因序列设计一对引物检测试验菌株CE129中是否含有sfmA基因,然后根据CE129的sfmA基因,再设计一对缺失引物,使其5’端与sfmA基因两侧序列同源,3’端与质粒pKD3的氯霉素抗性基因cat两侧序列同源,用于获得带氯霉素抗性基因的PCR产物,该产物经纯化后导入含有质粒pKD46的CE129菌株中,在Red重组酶Beta、Exo、Gam的作用下,cat基因与靶基因发生同源重组,将sfmA基因置换下来,通过氯霉素抗性平板筛选得到一次同源重组菌CE129△sfmA::cat。随后,将质粒pCP20电转导入一次重组菌内,利用其编码Flp重组酶识别cat阅读框两侧Flp位点,从而消除氯霉素抗性基因。最后,依据PCR检测及测序结果,确认成功构建缺失株CE129△sfmA。在上述缺失株的基础上,将表达sfmA基因的pBR322质粒电转化转入CE129△sfmA,得到回补株CE129△sfmA/psfmA。血清杀菌试验中,在与新鲜的SPF鸡血清混合孵育4 h后发现,CE129△sfmA比CE129抵抗血清补体杀菌的能力下降20.1%(P<0.05);生物被膜定性和定量试验结果都表明,相比于CE129,CE1 29△sfmA的生物被膜形成能力下降13%(P<0.05);鸡成纤维细胞系DF1细胞黏附试验结果表明,CE129△sfmA对DF1细胞的黏附能力和CE129相比下降了 41%(P<0.01);鸡巨噬细胞系HD-11细胞吞噬试验结果表明,HD-11细胞对CE129△sfmA的吞噬能力和CE129相比提高了 30%(P<0.01)。Real-Time PCR试验结果显示,和CE129相比,CE129△sfmA中Ⅰ型菌毛主要结构亚单位fimA基因、P菌毛前导蛋白papC基因、鞭毛相关fliC基因以及抗吞噬和血清杀菌相关的ompA、iss基因的转录水平分别下降 40%(P<0.01)、43%(P<0.001)、23%(P<0.01)、21%(P<0.01)和 18%(P<0.05)。综合以上数据,Sfm菌毛在细菌黏附、生物被膜形成、抗吞噬和血清杀菌等方面扮演重要角色,直接或间接参与了 APEC CE129对宿主的致病过程,上述研究为大肠杆菌致病机制的阐释提供了新的研究线索。