研究背景随着社会的发展,创伤性脑损伤(Traumatic brain injury, TBI)已逐渐成为当今社会公共卫生的一个重要问题,其突出特点为高发生率、高致残率以及高死亡率,目前已成为儿童和青壮年致残和致死的主要原因之一。统计表明15%-20%的死亡者年龄在5-35岁之间。TBI的原因大多为交通事故,其次为坠落伤和斗殴,且高速公路交通事故呈上升趋势。我国去年因车祸致死者约10万人,颅脑损伤居其首位。TBI是神经外科中最常见的疾病,有着较高的致残率和致死率。随着对颅脑损伤基础研究的不断进展,不少新理论、新方法、新技术已应用于临床救治工作中。TBI根据时间可分为原发性与继发性脑损伤两种。原发性损伤往往即刻发生并难以避免,而继发性损伤则发生于TBI后数小时至数天内。前者主要发生在外力作用的同时,如头皮撕裂、颅骨骨折、脑挫裂伤、弥漫性轴突损伤等；后者的损伤机制比较复杂,包括脑水肿、氧化应激损伤、细胞代谢紊乱、脑缺血、脑肿胀、炎症反应、氧自由基及神经递质的释放等,病理变化表现多种多样。本文主要对部分继发性脑损伤机制进行研究。TBI后可继发细胞代谢紊乱等复杂的病理生理反应,开始时可引发短暂的糖代谢升高,脑组织的糖利用率开始下降,继而出现细胞内乳酸堆积等一系列病理变化,导致细胞中毒、坏死或凋亡,最终导致细胞毒性脑水肿。酮体则是此过程中脑组织供能的主要燃料。正常脑组织主要由糖代谢来提供能量,但在功能不足或需求增加时,脑组织可以利用酮体,以代偿细胞代谢的变化,并且不同年龄时期对酮体的利用率也不同。酮体的神经保护作用已在神经退行性病变、脑缺血、癫痫以及创伤性颅脑损伤等多种病理情况下得到证实,但对生酮饮食(ketogenic diet, KD)在TBI后的作用研究鲜有报道,且其作用机制尚不清楚。核因子2-相关因子2(Nuclear factor-E2-related factor2, Nrf2)是一种抗氧化反应的主调节器,能诱导保护性反应基因,激活人体自身的保护性反应,从而抵御广谱的毒性物质和致病原对细胞的损伤。在正常或无应激条件下,Nrf2存在于细胞质中,与胞质接头蛋白(Kelch-like ECH-associated protein1, Keap1)结合在一起,无生物活性。当细胞受到应激时,Nrf2与Keap1分开,转运至细胞核内,并与抗氧化基因的启动区域抗氧化元件(Antioxidant Response Element,ARE)结合,启动抗氧化反应,转录并表达相关抗氧化蛋白。Nrf2介导的细胞保护反应无细胞特异性和器官特异性,已证实Nrf2可保护肺脏、肝脏、消化道、神经系统和心血管系统等多器官或组织。创伤性颅脑损伤后Nrf2的脑保护作用已有许多研究,Nrf2可激活抗氧化反应,减轻脑水肿及抗凋亡等诸多作用。研究目的目前仍无明显有效的方法降低创伤性颅脑损伤的死亡率。颅脑损伤救治的最终目的是降低致死率和致残率,并提高患者的生存质量。要达到这一目的,并非依靠单一的某种药物或某种措施即能达到,而需要一种综合治疗,即整个治疗过程中任何环节的疏漏均可导致最终治疗结果的不良。本实验通过研究生酮饮食对创伤性颅脑损伤后皮层Nrf2活性及下游抗氧化因子HO-1含量的影响,进一步明确生酮饮食在TBI后神经保护作用的机制,为TBI的治疗提供新的思路及理论依据。方法将48只出生后35天,重量约120g的SD大鼠随机分成4个组：假手术+正常饮食组(Sham+ND,n=12)、假手术+生酮饮食组(Sham+KD,n=12)、外伤+正常饮食组(TBI+ND,n=12)、外伤+生酮饮食组(TBI+KD,n=12)。采用Feeney’s自由落体模型装置制作大鼠TBI模型：戊巴比妥麻醉大鼠,于右侧距冠状缝及中线2.5mm处开骨窗,用40g砝码在10cm高度自由落下,垂直打击。假手术组只做开窗,不做垂直打击。模型制作好24小时后开始分别给予生酮饮食和正常饮食,一周后处死动物,期间无动物死亡,各组随机取6只大鼠损伤灶周围5mm内的脑组织一部分保存于-80℃冰箱,用于检测Nrf2活性及含量和HO-1含量,取各组剩余6只大鼠的整脑即刻用于检测脑组织含水量。1.十湿比重法测定脑组织含水量根据公式：(湿重—干重)／湿重×100%计算脑组织含水量百分比2.凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测Nrf2活性取1.75pmol/μl未标记的双链Nrf2核苷酸探针(5’-TTTTATGCTGTGTCAT GGTT-3’,5’-AACCATGACACAGCATAAAA-3’)和T4多核苷酸激酶,用[γ-32P]-ATP进行标记,总反应体积为10μl(包括60μg核蛋白,Nrf2探针1μl,2μl缓冲液,余为自由水),混匀后4℃放置20min,然后上样至已制好的聚丙烯酰胺凝胶样品孔中,恒压120V,电泳2小时。电泳结束后取下凝胶,放入暗盒中-80℃曝光、显影,采用Image J图像分析软件测量灰度值。3. Western blot检测Nrf2核蛋白及HO-1蛋白的含量取约100mg标本研磨,加入细胞裂解液分别提取核蛋白和胞浆蛋白,并用Bradford法测定蛋白质浓度。将提取好的核蛋白及胞浆蛋白煮沸3分钟后上样至已制好的聚丙烯酰胺凝胶孔中,以恒压90V电泳,直至溴酚蓝接近胶的下边缘,电泳结束后再将聚丙烯酰胺上的蛋白转膜到硝酸纤维膜上,封闭1小时,TTBS溶液漂洗3次后分别加入相应一抗,4℃孵育1小时,TTBS溶液洗膜3次,再加二抗,4℃孵育,1小时后用TTBS溶液洗膜3次,加入ECL发光剂,放置暗盒曝光,显影,采用Image J图像分析软件测量灰度值。4. RT-PCR检测HO-1mRNA表达水平取约50mg标本研磨,分别加入1ml Trizol,室温静置5min,再加0.2ml氯仿充分震荡,4℃离心15min,取上清液,再加0.5ml异丙醇,轻轻混匀后放置10min,离心10min,吸去上清液,加入1ml75%酒精,离心5min,吸去酒精,晾干,加DEPC水溶解,测定RNA浓度。按逆转录试剂盒说明,将RNA逆转录成cDNA,分别加入上、下引物及聚合酶,进行聚合酶链反应,将反应产物加入已制好的琼脂糖凝胶孔中电泳,电泳完毕后将琼脂糖凝胶放置凝胶成像仪中成像,采用Image J图像分析软件测量灰度值。5.统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计学分析。定量资料结果采用均数±标准差((?)±s)表示。多组均数间比较采用单因素方差分析,两两组间均数的多重比较,当方差齐同时用LSD检验,当方差不齐时用Tamhane’s T2检验。以P≤0.05为差别有统计学意义。结果1.脑组织含水量的变化：分别给予TBI组的大鼠生酮饮食和正常饮食一周后,各组间均数采用单因素方差分析,P<0.001生酮饮食组脑水肿程度较正常饮食组脑水肿明显减轻,分别是(79.55±0.41)%和(81.15±1.16)%,差别有统计学意义(P=0.001)。2.脑组织胞核中Nrf2活性的变化：正常大鼠分别用正常饮食和生酮饮食饲养一周后,生酮饮食组Nrf2的活性较正常饮食组高(P<0.001),颅脑创伤并给予一周生酮饮食后,同样较创伤后给予正常饮食组高(P<0.001)3.脑组织胞核中Nrf2蛋白含量及胞浆蛋白HO-1的含量：给予生酮饮食和正常饮食一周后,生酮饮食组胞核Nrf2含量均较正常饮食组高(P<0.001),并且HO-1蛋白含量同样升高(P=0.002)4.脑组织中HO-1mRNA水平变化：四组大鼠分别给予生酮饮食和正常饮食一周后,生酮饮食组HO-1mRNA的表达均较正常饮食组高(P=0.001,P<0.001)。结论氧化应激损伤是创伤性颅脑损伤后继发性脑损伤的重要原因,因此抗氧化应激对神经保护具有重要作用。生酮饮食可在创伤性颅脑损伤后减轻脑水肿,抑制细胞凋亡及抗氧化作用等。本实验结果表明生酮饮食可明显激活Nrf2,使之转运至细胞核,继而转录表达下游抗氧化蛋白HO-1,故我们认为创伤性颅脑损伤后,生酮饮食可能通过激活Nrf2途径发挥显著的神经保护作用。