一、研究背景支气管哮喘(bronchial asthma)是由多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症性疾病,这种慢性炎症常导致气道反应性的增高。气道平滑肌收缩带来的气流受限可引起的广泛而多变的气流阻塞而目前研究认为,哮喘病人的气道重塑是最终导致气流受限的关键因素。哮喘气道重塑主要是是以气道平滑肌增生肥大,粘膜组织化生,炎症细胞浸润,肌纤维母细胞增生,气道水肿和新生血管形成为特征,这也是气道高反应性的关键因素。气道重塑会造成气道对气管扩张剂及激素反应性下降,从而造成哮喘晚期气流受限不完全可逆。刺激哮喘气道平滑肌细胞收缩因素多种多样,主要包括变应原刺激、细菌病毒感染等对体内炎症细胞趋化、各种细胞因子释放及体内肾素血管紧张素系统(RAS)的激活等。哮喘作为一种慢性疾病,怎样才能针对以上环节减少气道重塑状态下的气流受限是目前迫切需要解决的问题。既往对RAS的研究多集中于心血管、肾脏、肝脏系统,证实其对细胞增殖、纤维化、炎症等方面有着重要作用。肺脏同样存在RAS系统组分及其受体,近来研究发现血管紧张素Ⅱ1型受体(AT-1R)在肺脏的高表达及ACE基因的多态性和哮喘发作有着重要关联,有研究证实哮喘病人的Ang Ⅱ水平是升高的。RAS对气道收缩的作用越来越多的收到人们的关注,其新组分血管紧张素转换酶2(ACE2)-血管紧张素-(1-7)(Ang-(1-7))-MAS轴的发现为疾病的治疗提供新的方向。ACE2与ACE虽同属一族但功能迥然不同。ACE是肽酰二肽酶,有两个催化区,而ACE2是羧肽酶,只有一个催化区,因此它们的底物不同。ACE2将AngⅠ和Ang Ⅱ的C端裂解分别产生Ang-(1-9)和Ang-(1-7); Ang-(1-9)可由ACE裂解为Ang-(1-7)。因为ACE2裂解产生的Ang-(1-7)要多数百倍,因此ACE2是产生Ang-(1-7)的关键酶。Mas受体又是Ang-(1-7)主要作用受体。目前研究证实ACE2-Ang-(1-7)-Mas受体轴是ACE-AngⅡ-AT-1R受体轴内在调节途径,有望成为哮喘治疗的新的靶点。目前国内外研究认为,在心血管、肾脏、肝脏等器官,Ang-(1-7)可拮抗Ang Ⅱ作用,具有抗增殖、抗炎、抗纤维化的作用。目前在血管平滑肌方面研究显示Ang Ⅱ通过激活RhoA,从而引发细胞收缩；Ang Ⅱ还可以通过Rho/ROCK信号通路对肾脏足突细胞骨架发生改变,其对于肝星状细胞的骨架及收缩活动也是有影响。前人研究给予我们重要的启示：RAS激活对于在支气管哮喘支气管平滑肌高反应性的病理生理发生发展中也有重要调节作用,但是其主要是通过什么信号途径,而Ang-(1-7)对气道平滑肌的收缩又有着什么样的作用,其是否对气道收缩同样有着抑制作用,这也是我们要研究证实的问题。Rho激酶是胞浆中一种小的鸟苷三磷酸酶,称之为ROCK2,是Rho/ROCK信号通路的重要组分,其与平滑肌细胞收缩表型的保持有着重要的关系。现阶段研究证实,Ang Ⅱ主要是通过Rho/ROCK信号通路发挥作用诱导平滑肌细胞收缩,而RhoA/ROCK信号通路在过敏性哮喘中气道高反应性息息相关。Rho/ROCK信号通路广泛的参与到细胞迁移、增殖、炎症及细胞骨架、细胞收缩等各个环节。肌动蛋白构成的细胞骨架是维持细胞形态,介导真核细胞必需的生物学功能的重要结构,参与细胞收缩、迁移等多个生物学过程。而Rho/ROCK信号通路中的RhoGTP酶家族作为Ras超家族的成员,是一类能结合GTP的蛋白质,并能通过其下游ROCK2发挥多种生物学效应,在调节细胞生命活动的信号通路网中发挥分子开关的作用。Rho GTP酶家族成员小分子的G蛋白具有GTP酶的活性,在细胞的信号转导通路中起重要作用,主要调节细胞增殖、炎症反应、细胞骨架结构排布及参与细胞收缩等。综上所述,RAS的激活与哮喘的发病息息相关,我们假设在HASMCs上AngⅡ也是通过RhoA/ROCK信号通路发挥作用诱导平滑肌细胞收缩,及Ang-(1-7)也可以通过调控Rho/ROCK信号通路来调节人气道平滑肌细胞的收缩。二、研究目的1.使用胶原收缩法在宏观上证实AngⅡ和Ang-(1-7)对原代培养人气道平滑肌细胞收缩的影响,其受体抑制剂是否可阻断其作用,。2.通过AT-1R抑制剂伊贝沙坦(IRB)、MAS受体抑制剂A779干预进一步证实二者的作用及其作用途径；ROCK2抑制剂Y-27632证实Rho/ROCK信号通路在其中的作用。3.通过对各个分组细胞F-actin的染色,证实AngⅡ和Ang-(1-7)及其受体阻断剂对原代培养的人气道平滑细胞细胞骨架的作用。4.通过对Rho/ROCK信号通路关键基因ARHGEF、RhoAGTP、ROCK2及蛋白moesin磷酸化水平的检测,证实其在AngⅡ和Ang-(1-7)调节HASMCs收缩中的作用。三、材料和方法1、经南方医院伦理委员会批准,患者同意,取南方医院胸外科手术标本,采用贴壁法原代培养人气道平滑肌细胞,并进行传代培养。2、组织块贴壁法培养人气道平滑肌细胞(Human Airway Smooth Muscle Cells, HASMCs),通过光镜下观察细胞形态和对细胞a-actin特异性免疫荧光染色进行HASMCs鉴定。3、实验分组将4-7代人气道平滑肌细胞分为6组：空白对照组、AngⅡ、 AngⅡ+Ang(1-7)、AngⅡ+Ang-(1-7)+A779、AngⅡ+IRB、AngⅡ+Y-27632.4、制备含细胞三维胶原,通过宏观上测量不同分组细胞胶原面积的大小反映分组细胞收缩情况。Image J软件测量胶原面积,各组面积相对比=(实验组胶原面积/原始胶原面积)×100%。5、用罗丹明-鬼笔环肽标记F-肌动蛋白显示HASMCs的细胞骨架,使用免疫荧光显微镜观察HASMCs骨架及肌丝的变化进一步在细胞水平上显示细胞收缩情况。6、实验分组：人气道平滑肌细胞分为5组：空白对照组、AngⅡ、AngⅡ+Ang(1-7)、AngⅡ+IRB、AngⅡ+Y-27632。使用real-time PCR方法检测RhoA/ROCK通路中的关键基因RhoGEFs、RhoAGTP、ROCK2mRNA表达的变化。7、Western blot检测AngⅡ在不同时间点对ROCK2底物蛋白moesin磷酸化水平变化。8、Western blot检测不同分组对RHhoA/ROCK通路关键蛋白,ROCK2底物,moesin蛋白磷酸化的影响。9、采用SPSS13.0统计软件进行结果分析,统计数据用均数±标准差(X±s)表示,组间比较用one way ANOVA分析,先进行方差齐性检验,方差齐,选用LSD即最小差异法；若方差不齐,采用校正的F检验(Welch法),并选用Dunnett T3做多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。四、结果1、倒置显微镜下观察,单个细胞呈梭形、多边形,融合后的HASMCs呈“峰谷征”“团状”,形状规则。使用α-actin特异性免疫荧光染色胞浆呈绿色,细胞纯度在95%以上。2、胶原收缩实验证实,各组胶原面积分别为(%)：82.56±1.85、42.24±4.38,75.62±1.40、67.95±1.81、76.16±±4.46、78.232.33(最初胶原面积为100%)。胶原面积与各组细胞收缩呈反比。由此可见,与对照组相比,AngⅡ可显著诱导HASMcs的收缩(p<0.05),Ang-(1-7)可抑制AngⅡ的作用(p<0.05)；二者的受体抑制剂均可阻断其作用,RhoA/ROCK通路抑制剂Y-27632较Ang-(1-7)和IRB可更显著抑制Ang Ⅱ诱导的HASMCs收缩(p<0.05)。3、罗丹明-鬼笔环肽免疫荧光染色显示,AngⅡ刺激可诱导HASMCs肌丝显著增多,细胞多呈板状,呈现出较强张力状态。Ang-(1-7)可抑制AngⅡ的作用,细胞肌丝数量减少。IRB可拮抗AngⅡ的作用,A779可拮抗Ang-(1-7)对AngⅡ的抑制作用,细胞肌丝较AngⅡ+Ang-(1-7)组显著增加。Y-27632也可显著抑制AngⅡ诱导的HASMCs肌丝的增加,且多呈丝状,呈现出较弱的张力状态。4、实时定量PCR显示,Ang Ⅱ可激活Rho/ROCK信号通路,ARHGE1、 RhoAGTP、ROCK2mRNA表达显著增加(p<0.05),Ang-(1-7)、AT1R抑制剂IRB与ROCK2抑制剂Y-27632均可显著抑制其作用(p<0.05)。5、Western Blot显示当AngⅡ浓度为10-7M时,,5min后AngⅡ即可引起moesin蛋白表达水平的增加,15min后可达到顶峰,之后随时间增加而逐渐减弱。6、Western Blot显示,P-moesin/moesin灰度比值分别为：0.72±0.03、1.48±0.03、0.67±0.03、0.91±0.03、0.61±0.01、0.83±0.02。由此可见AngⅡ可诱导RhoA/ROCK信号通路关键蛋白,ROCK2底物moesin磷酸化表达显著增加(p<0.05),Ang-(1-7)对其有抑制作用(p<0.05)。ROCK2抑制剂Y-27632比AT1R抑制剂IRB更显著抑制Ang Ⅱ的作用,(p<0.05)。结论：血管紧张素Ⅱ可诱导HASMCs的收缩,血管紧张素-(1-7)对其有抑制作用；二者可以通过相应的受体调节Rho/ROCK信号通路而发挥作用的。