多药耐药是癌症化疗成功的主要障碍,而癌细胞能对结构各异机制不相关的药物产生耐药性,一个主要的原因就是多药耐药(multidrug resistance,MDR),多药耐药和药物外排转运体MDR1(multidrug resistance 1,MDR1)过表达相关。MDR1是一个被多药耐药1基因编码的170KD的膜糖蛋白,是ATP依赖的具有药物外排功能的转运蛋白。在肿瘤细胞中,MDR1泵出抗癌药物导致肿瘤细胞产生耐药性,NF-κB(nuclear factor κ-B,NF-κB)是作为转录因子介导MDR1导致耐药的蛋白复合物。NF-κB的激活需要IκB-α的磷酸化,即p-IκB-α(phosphorylation of inhibitor κB-α,p-IκB-α)显著的增加导致 NF-κB 激活。克服MDR1介导的耐药性可以通过阻碍外排泵的功能和抑制它的表达来实现。因此,抑制MDR1介导的药物外排将引起化疗药治疗的多药耐药癌细胞的复敏,可以被认为是对具有多药耐药癌症患者的有效治疗方法。目前,临床上的一些抗癌药如生物碱、蒽环类抗生素和表鬼臼毒素很容易产生多药耐药,因此急需开发有效的多药耐药逆转剂。另外,大剂量甲氨蝶呤可以达到常规化疗剂量、化疗方案作用不到的盲区部位,从而提高化疗的效果,但甲氨蝶呤具有潜在的细胞毒性,且剂量越大,出现不良反应的机会越大,会引起胃肠道黏膜损伤,表现出恶心、胀气、呕吐、厌食、腹泻和腹痛等症状,导致患者的体重下降和营养不良。甲氨蝶呤是MDR1的底物,寻找一种多药耐药的抑制剂,抑制MDR1,在降低甲氨蝶呤的剂量的同时提高甲氨蝶吟的小肠吸收,可以有效减轻甲氨蝶呤致消化道黏膜炎。薯蓣皂苷是一个天然药物的有效成分,广泛存在于一些药用植物中,如穿龙薯蓣、盾叶薯蓣和山药中,药理学研究已证实这个化合物具有抗氧化、降脂、抗癌、保肝的作用,而且是合成甾体激素类药物的重要原料,因此含此类成分生药的应用前景十分广阔。多药耐药机制的研究依赖于对经过选择的且对广谱抗癌药存在交叉反应性的癌细胞系的分析。已有研究结果证实,薯蓣皂苷能逆转肝癌细胞HepG2对阿霉素(adriamycin,ADR)的耐药性,其在白血病和乳腺癌中对阿霉素的耐药和甲氨蝶呤吸收的影响还未见报道。我们利用了一个阿霉素敏感的白血病细胞系(Human doxorubicin-sensitive erythroleukemic cells,K562 cells)、来源亲本细胞 K562 的阿霉素耐药的细胞系(Human doxorubicin-res的磷酸化抑制了 NF-κB的活性进而下调了 MDR1的表达。istant erythroleukemic cells,K562/ADR cells)、表达分化的小肠细胞特征的细胞系(human colon adenocarcinoma cells,Caco-2 cells)、一个阿霉素敏感乳腺癌细胞系(human adriamycin-sensitive breast cancer cells,MCF-7 cells)、来源亲本细胞MCF-7的阿霉素耐药的细胞系(human adriamycin-resistant breast cancer cells,MCF-7/ADR cells)等肿瘤细胞模型和大鼠小肠来研究薯蓣皂苷对阿霉素耐药和甲氨蝶呤吸收的影响,旨在阐明此效果及其分子药理学机制即薯蓣皂苷对MDR1表达的影响及MDR1的表达和NF-κB信号通路的关系。第一部分 薯蓣皂苷对人白血病细胞K562/ADR多药耐药的逆转效果及分子药理学机制目的:研究薯蓣皂苷对白血病细胞多药耐药的逆转效果,探讨薯蓣皂苷逆转白血病细胞多药耐药的分子药理学机制。方法:以人红白血病细胞系K562及其阿霉素耐药细胞系K562/ADR为研究对象,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(噻唑蓝)(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe-nyltetrazolium bromide,MTT)法检测细胞毒性作用;以流式细胞术测定两种细胞系内薯蓣皂苷对阿霉素细胞内蓄积的影响来反映薯蓣皂苷对MDR1外排功能的影响;Western Blotting检测MDR1、phospho-IκB-α的蛋白表达水平;Quantitative PCR法检测MDR1的mRNA表达水平;双荧光素酶报告分析系统检测MDR1和NF-κB启动子活性。结果:与K562细胞系相比,K562/ADR耐药细胞系中MDR1的mRNA和蛋白均高表达,且耐药细胞中的阿霉素细胞内潴留减少。薯蓣皂苷对K562和K562/ADR表达出大致相同的细胞毒性,由此计算出薯蓣皂苷无毒性的浓度即IC10(10%inhibiting concentration,IC10)为0.3 μM。此浓度的薯蓣皂苷显著增加了阿霉素在耐药细胞中的蓄积,导致阿霉素在耐药细胞中的IC50(50%inhibiting concentration,IC50)值由42.4±2.6 μM减少到2.4±0.1 μM,即薯蓣皂苷显著增加了阿霉素的细胞毒性,表明薯蓣皂苷通过增加阿霉素在耐药细胞内的蓄积增加了阿霉素的细胞毒性。而且,薯蓣皂苷呈浓度依赖性和时间依赖性抑制了 K562/ADR细胞的MDR1的mRNA和蛋白的表达,表明薯蓣皂苷通过抑制MDR1的表达增加了阿霉素的细胞内蓄积进而逆转了阿霉素的耐药。另外,薯蓣皂苷抑制了 MDR1和核因子NF-κB的启动子活性以及IκB-α的磷酸化,表明薯蓣皂苷通过抑制IκB-α的磷酸化抑制了 NF-κB的活性进而下调了 MDR1的表达。结论:薯蓣皂苷在白血病细胞K562/ADR中通过抑制NF-κB信号通路抑制了MDR1转运体,恢复阿霉素的敏感性,逆转了白血病细胞的耐药,表明薯蓣皂苷和阿霉素合用能有效提高白血病的治疗效果,薯蓣皂苷可能是一个新的多药耐药逆转剂和潜在的肿瘤化疗辅助剂。第二部分 薯蓣皂苷对甲氨蝶呤吸收的影响及其分子药理学机制目的:研究薯蓣皂苷在体内外对甲氨蝶呤吸收的增强效果,探讨其分子药理学机制。方法:利用MTT法分析薯蓣皂苷在Caco-2细胞对甲氨蝶呤细胞毒性的影响,Caco-2细胞双向转运实验分析薯蓣皂苷对甲氨蝶呤转运的影响,体外翻转肠和原位肠灌注实验考察薯蓣皂苷对甲氨蝶吟体内外吸收的影响,液相色谱串联质谱(chromatography andem mass spectrometry,LC-MS/MS)方法测定生物样品中甲氨蝶呤的浓度,大鼠小肠切片病理学检查考察薯蓣皂苷对甲氨蝶呤诱导的肠道粘膜损伤的影响,Western blotting、Quantitative RT-PCR(Quantitive Real Time-polymerase chain reaction,Quantitative RT-PCR)、双荧光素酶报告基因分析系统等分子生物学技术考察薯蓣皂苷对甲氨蝶呤吸收影响的分子药理学机制。结果:薯蓣皂苷在Caco-2细胞中72小时细胞毒性作用最明显,72小时作为整个试验的检测时间。用甲氨蝶呤和薯蓣皂苷处理72小时后,仅有甲氨蝶呤和薯蓣皂苷+甲氨蝶呤的IC50值分别是19.5±0.9 μM和7.7±0.1μM,也就是合用薯蓣皂苷减少了甲氨蝶呤的IC50值,表明薯蓣皂苷增加了甲氨蝶呤在Caco-2细胞的毒性。薯蓣皂苷还增加了甲氨蝶吟在吸收方向的转运,减少了甲氨蝶吟在分泌方向的转运,显著抑制了 Caco-2细胞中MDR1的mRNA和蛋白的表达,表明薯蓣皂苷通过抑制Caco-2细胞中MDR1的表达,增加了甲氨蝶呤的吸收方向的转运。而且,薯蓣皂苷抑制了 MDR1和NF-κB启动子的活性以及IκB-α的磷酸化,表明薯蓣皂苷通过抑制IκB-α的磷酸化抑制了 NF-κB信号通路,进而下调了 MDR1的表达,增加了甲氨蝶呤的转运。薯蓣皂苷体内外通过下调MDR1的表达增加了甲氨蝶呤的小肠吸收。另外,尽管甲氨蝶呤吸收进入了肠细胞,但没有观察到毒性的增加,而且,事实上,观察到毒性减少了。结论:薯蓣皂苷通过抑制NF-κB信号通路抑制Caco-2细胞MDR1转运体,增加甲氨蝶吟吸收方向上的转运,在大鼠中薯蓣皂苷通过抑制MDR1转运体,体内外增加了甲氨蝶呤的小肠吸收,但没有增加甲氨蝶呤诱导的肠道粘膜损伤,表明薯蓣皂苷在降低甲氨蝶呤剂量的同时可能提高其治疗效果,其可能作为甲氨蝶呤吸收的多药耐药调节剂。第三部分 薯蓣皂苷对乳腺癌细胞及其耐药细胞的增敏效果及其分子药理学机制目的:研究薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中对阿霉素活性的增敏效果及其分子药理学机制。方法:利用MTT分析在人乳腺癌细胞MCF-7及其耐药细胞系MCF-7/ADR薯蓣皂苷本身的毒性及薯蓣皂苷对阿霉素活性的影响,Western blotting、Quantitative RT-PCR、双荧光素酶报告基因分析系统等分子生物学方法来检测其分子药理学机制。结果:薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞的IC50分别是6.5±0.4μM和7.3±0.2μM,即薯蓣皂苷对药物敏感的亲本乳腺癌细胞和多药耐药乳腺癌细胞具有大致相同的抗性,由此得出薯蓣皂苷对MCF-7/ADR和MCF-7细胞没有毒性的浓度,即IC10,均为0.4±0.1μM。0.4μM的薯蓣皂苷分别将MCF-7和MCF-7/ADR细胞中IC50 值由 1.5±0.1μM 和 34.7±1.1μM 减少到 0.4±0.1 和 0.7±0.1μM,表明薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞均有增加阿霉素细胞毒性的效果。薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞均呈浓度依赖性和时间依赖性抑制了 MDR1的mRNA和蛋白的表达,表明薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞均是通过抑制MDR1增加阿霉素细胞内的毒性。而且,薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞均抑制了 MDR1和NF-κB启动子的活性和IκB-α的磷酸化,表明薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞均通过抑制IκB-α的磷酸化抑制了 NF-κB信号通路进而下调了 MDR1的表达增加了阿霉素细胞内的毒性。结论:薯蓣皂苷通过抑制NF-κB信号通路下调药物转运体MDR1的表达,增加了 MCF-7和MCF-7/ADR细胞中阿霉素的化学敏感性,表明薯蓣皂苷和阿霉素合用能有效提高乳腺癌的治疗效果,这一发现为薯蓣皂苷作为化疗辅助剂进一步临床应用提供了又一有力的证据。