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目的: 胎儿心脏约在妊娠10周时已经成型,在之后的心脏发育过程中,胎儿心肌在能量代谢、心肌纤维排列和心肌细胞增殖能力等方面发生很大变化。研究已经发现lncRNA参与多种器官的发育过程,因此,我们推测lncRNA的表达可能会影响心脏的发育过程。本课题组拟通过lncRNA芯片分析13-17周胎儿心肌和30-40岁成年人心肌组织的差异lncRNAs和mRNAs表达,通过生物信息学分析差异lncRNAs的生物学功能,为探讨lncRNAs在心脏发育中的作用机制奠定基础。 方法: 1.收集6例13-17周胎儿心脏和6例30-40岁成年人心脏,取各例部分组织做HE染色观察胎儿和成人心肌纤维排列情况;Masson染色观察胶原含量情况;免疫荧光染色观察胎儿和成人心脏的心肌细胞增殖情况。提取各例左心室组织总RNA。 2.通过lncRNA芯片,检测胎儿和成人心脏组织的lncRNA和mRNA表达谱,以胎儿组和成人组差异倍数大于或等于2、P值小于或等于0.05和错误发现率(FDR)小于或等于0.05为标准,筛选出胎儿组和成人组存在的差异表达lncRNAs和mRNAs。 3.对差异表达mRNAs进行显著性功能分析(GO Analysis)和显著性信号通路分析(Pathway Analysis),得到胎儿与成人心肌差异表达mRNAs所参与的显著性功能和信号通路。 4.建立差异lncRNA-mRNA共表达网络,利用皮尔逊相关系数预测差异表达lncRNAs的靶基因,以皮尔逊相关系数绝对值大于或等于0.9998和P值小于0.001为标准,找到差异表达lncRNA可能的靶基因;分析差异表达lncRNA与mRNA的基因位置关系,利用cis分析差异表达lncRNAs可能相关的靶基因;对差异lncRNAs的预测靶基因进行显著性功能分析,得到差异基因所参与的显著性、靶向性功能;对差异lncRNAs的靶基因进行显著性信号通路分析,得到差异基因所参与的显著性信号通路。 5.利用BLAST对差异倍数大于10倍的lncRNA进行人与小鼠间的序列比对。 6.实时荧光定量PCR技术验证差异表达的lncRNAs:选取具有代表性的差异表达的lncRNAs,采用荧光定量PCR技术验证其在胎儿组和成人组的差异表达。 结果: 1.HE染色显示成人心肌纤维排列较胎儿心肌纤维更整齐有序,成人心肌纤维为长条形,而胎儿心肌纤维为多角形;Masson染色显示成人心肌有更高的胶原含量;免疫荧光染色结果显示13-17周胎儿心肌可见的明显的增殖心肌细胞,而成人心肌中无心肌细胞增殖。 2.lncRNA芯片分析结果显示,胎儿组和成人组存在5738个差异表达的lncRNAs,其中2538个在成人组发生下调,3200个发生下调。差异表达的mRNA有5547个,其中在成人组下调的有3220个,上调的有2327个。 3.对差异表达mRNAs进行显著性功能分析和显著性信号通路分析,结果显示成人组下调mRNAs参与52个显著性功能类别和20个信号通路,主要与细胞周期相关;成人组上调mRNAs参与23个功能类别和10个信号通路,主要与抗原性及离子通道相关。 4.对差异表达的lncRNAs和差异表达的mRNAs进行共表达网络分析,发现502对lncRNA-mRNA存在共表达关系,其中439对lncRNA-mRNA为正相关,63对为负相关。LncRNA CTD-2384A14.2-mRNA SMCHD1、lncRNA RP1-240B8.3-mRNA BAIAP2L2和lncRNA RP11-474I16.8-mRNA MIF具有最高的负相关系数。lncRNARP11-710F7.3-mRNA MSL2、 lncRNA XLOC_006166-mRNA Cxorf27和 lncRNAXLOC_009300-mRNA MMP1具有最高的正相关系数。结果显示LncRNA AX747860和lncRNA RP11-119F7.5有最多的靶基因,各15个。 5.对差异表达的lncRNAs进行其与mRNA基因位置关系分析,差异表达的lncRNAs与mRNA有6种位置关系,可将5738个lncRNAs分为269个intronsense-overlapping lncRNAs、317个 exon sense-overlapping lncRNAs、674个intronic antisense lncRNAs、656个natural antisense lncRNAs、3,505个intergenic lncRNAs和317个bidirectional LncRNAs。其中,lncRNAENST00000425771是intergenic lncRNAs,已发现其与多种细胞增殖有关;LncRNANR_038439是intronic antisense lncRNA,其邻近基因是与T型钙离子通道相关的基因CACNA1G; LncRNA uc001kgu.3是exon sense-overlapping lncRNA,其邻近基因为KIF20B,此基因与细胞增殖周期相关。 6.对通过lncRNA-mRNA共表达网络分析和基因位置关系分析得到的靶基因进行显著性功能分析和信号通路分析,结果显示这些靶基因的主要富集功能为心血管系统发育,主要富集的信号通路为致心律失常性心肌病通路和p53通路。 7.利用BLAST对差异lncRNAs进行人与小鼠序列比对后,发现lncRNAASHGA5P003269和lncRNA ENST00000523269在小鼠中存在相似序列,分别为lncRNA NR_045363.1和lncRNA NR_045402。 8.通过实时荧光定量PCR验证差异表达的lncRNAs,显示结果与芯片分析结果一致。 结论: 1.通过lncRNA芯片分析发现了胎儿组和成人组差异表达的lncRNAs和mRNAs。 2.通过对胎儿与成人心肌差异表达mRNAs进行显著性功能分析和信号通路分析,明确了差异mRNA可能参与生物学功能。 3.通过分析差异lncRNAs和差异mRNAs的共表达关系以及差异lncRNAs与mRNA的基因位置关系,确定了lncRNAs可能的靶基因。 4.通过对差异lncRNAs的靶基因进行显著性功能分析和信号通路分析,明确了差异lncRNA可能参与生物学功能。 5.利用BLAST对差异lncRNA进行序列比对,发现2条lncRNA在小鼠中存在相似度较高的序列。