论文部分内容阅读
鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus, DHAV)引起的鸭病毒性肝炎主要侵害3周龄以下雏鸭,死亡率高达90%以上。VP1蛋白位于DHAV衣壳表面,是其主要的结构蛋白之一,也是病毒粒子抗原性的主要组成部分。已有研究资料表明,1型和3型鸭甲肝病毒(DHAV-1和DHAV-3)存在抗原交叉,为建立简单快速的检测DHAV-1和DHAV-3抗体的方法,本研究对DHAV-1 X株的结构蛋白VP1基因进行密码子优化后克隆到pET-28a(+)载体中,构建重组表达质粒pET-28a(+)/optiVP1并进行原核表达,纯化表达蛋白,开展了基于密码子优化型VP1重组蛋白的检测DHAV-1和DHAV-3抗体的胶体金免疫层析试纸条的研制等一系列研究,主要结果如下：1. DHAV-1 VP1基因稀有密码子及抗原表位分析通过生物信息学在线网站分析1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)X株VP1基因稀有密码子情况和抗原表位,发现VP1中含26个稀有密码子,稀有密码子含量较多,且存在五处连续稀有密码子,1-72位氨基酸序列和83-238位氨基酸序抗原表位较丰富。并根据大肠杆菌密码子偏嗜性对VP1密码子进行改造,人工合成密码子优化型VP1 (optiVP1)基因。2.VP1和optiVP1基因克隆表达、鉴定及纯化通过RT-PCR扩增了预期大小的DHAV-1-X VP1全基因序列,将目的片段VP1和optiVP1分别克隆至pET-28a(+)上,构建两种原核表达质粒pET-28a (+)/VP1和pET-28a (+)/optiVP1并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行原核表达。结果表明,只有optiVPl成功表达,在0.4 mmol/LIPTG、37℃诱导12h的表达量最大,表达的重组蛋白大小约为32 kDa,以包涵体的形式存在。采用切胶回收方法获得纯度较高的重组蛋白,Western blot分析结果表明该蛋白可被兔抗DHAV-1抗体和兔抗DHAV-3抗体识别,具有良好的反应原性。3. optiVPl多克隆抗体的制备用纯化的optiVP1蛋白免疫昆明鼠,制备的鼠抗optiVP1高免血清的间接ELISA效价达到1：51200,间接免疫荧光试验证实该鼠抗optiVP1血清能识别DHAV-1和DHAV-3,表明optiVP1具有良好的免疫原性。4. 检测DHAV抗体的金标试纸条的研制及应用以optiVP1蛋白为抗原制备了双抗原夹心法(ICS-SM)和间接法(ICS-ID)检测DHAV抗体的胶体金免疫层析试纸条,特异性试验结果表明制备的金标试纸条能够检测DHAV-1抗体和DHAV-3抗体,对鸭疫里默氏菌(RA)、鸭瘟、鸭大肠杆菌和鸭沙门氏菌等鸭常见病的阳性血清检测结果为阴性,特异性好。敏感性试验结果表明,当DHAV-1阳性血清作1：64稀释时,检测结果仍呈阳性；当DHAV-3阳性血清作1：32稀释时,检测结果仍呈阳性。对16份临床鸭血清样本的检测限度结果表明双抗原夹心法试纸条的灵敏度与中和试验相当甚至高于中和试验,间接法试纸条敏感性与中和试验相当。双抗原夹心法试纸条和间接法试纸条与间接ELISA方法检测结果的符合率分别为82.3%(93/113)和85.8%(97/113),与中和试验的符合率均为100%(16/16)。制备的双抗原夹心法试纸条和间接法试纸条稳定性好,可在4℃至少保存6个月。