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目的:急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）是冠状动脉粥样硬化性心脏病（Coronary heart disease,CHD）中最危急和最严重的类型,临床治疗指南推荐尽快开通闭塞血管使冠状动脉恢复血流为最佳治疗手段。然而,当血管开通使心肌得到再灌注时,有些患者却出现心律失常、血管无复流、心肌坏死范围扩大等心肌缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI）的现象,随着再灌注手段的发展与应用,再灌注损伤的现象越来越得到重视。再灌注损伤的发生机制十分复杂,再灌注过程中一些因素激活细胞凋亡、坏死等多条信号转导通路,最终导致心肌的损伤、坏死。随着对基因研究的深入以及生物信息学的发展,长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,LncRNAs）被发现可以直接或间接调控编码蛋白基因或蛋白,成为近几年心肌缺血再灌注损伤机制及防治的研究热点。寻找参与调控的LncRNA并深入研究调控机制成为防治心肌缺血再灌注损伤的一个新的切入点。LncRNA GAS5（growth arrest specific 5,生长抑制特异因子5）被认为是肿瘤的抑制因子,发挥抑癌基因作用,可以抑制细胞的增值、转移,促进凋亡的发生。尽管心肌缺血再灌注损伤与细胞凋亡关系紧密,但GAS5在其中的作用却鲜有报道。本研究旨在探讨GAS5在心肌缺血再灌注损伤中的表达,靶向调控GAS5基因表达能否发挥减轻心肌缺血再灌注损伤的作用,并揭示其潜在机制。研究方法:1、大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的建立选用雄性Wistar大鼠数量为20只,随机分为两组,分为对照组和缺血再灌注组,每组10只。对照组不做灌流处理,直接留取心肌组织。缺血再灌注组用Langendorff离体心脏灌注系统制备大鼠离体心脏MIRI模型。停灌30分钟再灌注120分钟制备MIRI模型。灌流结束后,立即取下心脏留取心肌组织。2、大鼠H9c2心肌细胞培养及缺氧复氧损伤模型的建立大鼠H9c2心肌细胞系,从中国科学院上海细胞库购置。使用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃,5%CO2条件下培养。待至密度为80%左右,进行缺氧处理,把完全培养基更换为无糖培养基,将细胞放置低氧环境（37℃、95%N2、5%CO2）下培养8小时。之后进行复氧处理,把无糖培养基更换为完全培养基,将细胞置于常氧环境（37℃、5%CO2）下培养2小时。3、细胞转染采用瞬时转染的方法,使用lipo3000将siRNA、miRNA mimic、miRNA inhibitor以及阴性对照片段按照说明书的实验方法转入H9c2心肌细胞系,转染24-72小时后根据不同实验要求进行后续实验。4、CCK8法比较正常培养细胞、缺氧复氧处理细胞、转染siGAS5或转染miR-532-5p mimic/inhibitor后进行缺氧复氧诱导的心肌细胞活性。5、测定正常培养细胞、缺氧复氧处理细胞、转染siGAS5或转染miR-532-5p mimic/inhibitor后进行缺氧复氧处理的心肌细胞LDH、CKMB、GSH的酶活性程度。6、Hoechst染色和流式细胞术测定正常培养细胞、缺氧复氧处理细胞、转染siGAS5或转染miR-532-5p mimic/inhibitor后进行缺氧复氧处理的心肌细胞凋亡情况。7、Western blot测定正常培养细胞、缺氧复氧处理细胞、转染siGAS5或转染miR-532-5p mimic/inhibitor后进行缺氧复氧处理的心肌细胞中凋亡蛋白Bcl2、Bax、Caspase3、PTEN的蛋白表达。测定正常培养细胞、缺氧复氧处理细胞、转染siGAS5或转染miR-532-5p mimic/inhibitor或共转染后进行缺氧复氧处理的心肌细胞中PTEN、PI3K、AKT蛋白表达。8、Realtime PCR检测缺血再灌注损伤心肌组织和缺氧复氧损伤心肌细胞GAS5基因表达;检测缺氧复氧损伤心肌细胞miR-532-5p、PTEN基因表达;检测正常培养细胞、缺氧复氧处理细胞、转染siGAS5或转染miR-532-5p mimic/inhibitor后进行缺氧复氧处理的心肌细胞GAS5、miR-532-5p、PTEN的基因表达。9、荧光素酶报告基因实验检测GAS5与miR-532-5p、miR-532-5p与PTEN是否结合并验证结合位点。10、统计分析:数据表示以均数±标准差来表示,如果为两组间比较采用独立样本t检验,如果为多个样本间比较则先采取单因素方差分析的统计方法,若组间存在统计学差异则需进一步采用LSD检验方法进行两两比较,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:第一部分:通过PCR实验验证,与对照组相比,在大鼠缺血再灌注处理心肌组织以及缺氧复氧处理的大鼠H9c2心肌细胞中,GAS5其表达水平明显上调。在建立大鼠H9c2心肌细胞缺氧复氧模型的基础上进行功能学方面的研究,经缺氧复氧诱导的H9c2心肌细胞活性明显下降、出现较严重的细胞损伤,并出现明显的细胞凋亡。预先沉默GAS5处理再进行缺氧复氧,与HR+siNC对照组相比,HR+siGAS5组的细胞活性得到一定程度的恢复,心肌酶水平明显降低,细胞凋亡现象减轻,凋亡蛋白的表达情况也出现了明显的变化。第二部分:在建立大鼠H9c2心肌细胞缺氧复氧模型的基础上,研究GAS5参与心肌缺血再灌注损伤的调节机制。结合生物信息学分析的方法,预测GAS5的ceRNA调控网络及结合靶点。进行PCR实验表明在缺氧复氧情况下GAS5、PTEN出现高表达,而miR-532-5p出现低表达,符合ceRNA机制的基因表达趋势。进一步通过单独细胞转染siRNA或mi RNA模拟物/抑制剂,PCR验证其他基因的表达,结果发现GAS5、miR-532-5p和miR-532-5p、PTEN存在负反馈调节机制,进一步进行荧光素酶报告基因实验证实了结合靶点。同时验证miRNA与心肌缺氧复氧损伤的关系,单独对miR-532-5p进行过表达及沉默干预,结果表明过表达miR-532-5p,缺氧复氧处理后的细胞活性、损伤程度及凋亡情况的变化与沉默GAS5的结果趋势一致,而沉默miR-532-5p后的结果却相反。为了进一步证实GAS5/miR-532-5p/PTEN/PI3K-AKT轴在缺氧复氧诱导的细胞凋亡中的调控机制,设计挽救实验。将siGAS5和mi R-532-5p抑制剂分别和共转染至H9c2心肌细胞,然后进行缺氧复氧处理,检测PTEN、PI3K、AKT及其磷酸化蛋白的表达。结果表明单独转染siGAS5可降低PTEN蛋白表达,单独转染mi R-532-5p抑制剂可上调PTEN表达,而当细胞同时转染siGAS5和miR-532-5p抑制剂时,PTEN的表达趋势被显著逆转。沉默GAS5激活了PI3K/AKT途径,共转miR-532-5p抑制剂后会抑制该途径,说明GAS5的沉默促进了PI3K/AKT信号通路的激活,而这是结合miR-532-5p后使后者不能对PTEN起到调控作用所致。结论:1、GAS5在大鼠心肌缺血再灌注损伤的心肌组织及缺氧复氧处理的H9c2心肌细胞系中的表达均显著增高。2、沉默GAS5可以减轻缺氧复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤。3、mi R-532-5p参与心肌缺血再灌注损伤的调控,过表达miR-532-5p可以减轻缺氧复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤。4、GAS5作为ceRNA,吸附miR-532-5p,进而调控PTEN表达,最终通过PI3K/AKT途径来诱导细胞凋亡,参与心肌缺血再灌注损伤的病理学过程。