疟疾是流行范围最广、历史最长、危害最大的人类寄生虫传染病,长期以来一直是第三世界国家发病率和死亡率最高的病种之一。全球每年有3-5亿疟疾临床病例,其中死亡人数达三百多万。青蒿素是我国学者首次从黄花蒿（Artemisia annua L.）中分离得到的一种倍半萜内酯过氧化物,是治疗疟疾的特效药,国际市场需求量非常大。此外,进一步的药理研究证明,青蒿素及其相似物具有杀死癌细胞的作用,而对正常细胞损伤很小,并且与传统化疗药不存在交叉耐药。因此,有望将青蒿素及其类似物开发成高效、低毒、价廉、谱广的抗癌新药,具有广泛的应用前景。然而,目前药用青蒿素均是从黄花蒿植株中提取,由于其含量低,提取工艺复杂,安全隐患较大,导致青蒿素的生产成本过高。因此,如何有效降低青蒿素生产成本是近年来备受关注的难点与热点问题。本文旨在通过黄花蒿品种资源的创新以及青蒿素生产副产物的回收利用,为低成本生产青蒿素提供新的途径。本研究取得了如下结果：1、通过比较不同黄花蒿外植体对不同农杆菌抑制剂的耐受性,发现节间茎对Carb的耐受性最好适合黄花蒿的遗传转化,从而解决了因对农杆菌抑制剂不耐受性而严重影响黄花蒿的遗传转化的难题,建立了黄花蒿成本低、转化率高、重复性较好、再生能力较强的高效转化与再生体系。进而系统分析了黄花蒿转化效率的影响因素,包括选择压力、预培养时间、侵染时间和侵染液组成,建立了根癌农杆菌介导的黄花蒿高效低成本转化体系。本高效转化和再生体系的转基因植株的得率为20%左右,所用时间为7-8周。2、结合三大诱变系统,包括体细胞变异,EMS和UV处理,获得了一批黄花蒿优异种质。其中,易生根突变不定根数目较野生株提高了2-5倍,不定根发生率（约95%）是野生株的两倍左右,但其地上部分株型、茎横切面超微结构、腺毛密度与野生型黄花蒿无明显差异。该突变株在干旱逆境条件下可能因其根系发达表现出较强的抗旱性,在黄花蒿的无性繁殖中将发挥重要作用。一个突变株具有株型紧凑的优良性状,且遗传性稳定。抗白粉病突变株的获得,为抵御引起黄花蒿严重减产的白粉病奠定了种质基础。此外,还获得了一个叶茂型黄花蒿突变株,其叶片生长茂密直接提高了叶生物产量,从而提高了青蒿素产量,具有广阔的推广前景。3、采用代谢组学和体外实验探讨了易生根突变株的生根机理,结果表明,该突变株中青蒿素、可溶性糖、叶绿素和类胡萝卜素含量与野生型黄花蒿均无明显差别,但2-茨醇的含量较野生株高10倍,且无樟脑存在,而野生株中樟脑含量较2-茨醇的含量高10倍。体外实验表明,2-茨醇[（+）-borneol]显著促进黄花蒿不定根的发生,而樟脑对不定根的形成没有明显影响。4、采用定量蛋白组学技术分离了野生型黄花蒿与易生根突变株之间差异蛋白。结果鉴定到的蛋白数量1292个,其中1025个（79.3%）蛋白质表现与已知功能的蛋白有显著相似性,112个（8.7%）蛋白质与未知的蛋白质有显著相似性,其它155个（12%）蛋白质与公共数据库中的任何蛋白质无显著相似性。根据功能可以将总蛋白分为22类,包括RNA的合成、信号转导、抗逆、蛋白质的合成、代谢、次生代谢、能量、细胞生长／分裂、转录、蛋白质目的地／储存、运输、细胞结构、疾病／防御和未知蛋白。野生型黄花蒿与易生根突变株中差异蛋白共80个,其中在突变株中富集的蛋白45个,在野生型中富集的蛋白35个。在突变株中富集的45个蛋白中,功能已知的31个,在公共蛋白数据库中有同源性但功能未知的9个,5个蛋白在公共数据库中找不到同源性蛋白。5、从野生型黄花蒿与易生根突变株之间差异蛋白中挑选了1个可能与2-茨醇氧化相关的酶即2-茨醇脱氢酶（AaBDH）,采用快速扩增cDNA末端法（rapid amplification of cDNA end, RACE）,克隆了该基因的全长cDNA序列。该基因全长为1415 bp,该序列包含一个885个碱基的完整编码区,共编码294个氨基酸,分子量31043.4 Da,理论等电点PI 6.16。该基因编码的氨基酸序列与西红柿（Solanum lycopersicum）花姜酮合成酶S1ZBS （XP₀04249781.1）相似性为70%,毛果杨（Populus trichocarpa）乙醇脱氢酶PtADH（EEE92928.1）相似性为69%,川桑（Morus no tabbili）稻内酯酶MnMLAS （EXC01949.1）相似性为68%,与蓖麻（Ricinus communis）短链脱氢酶RcSAD （EEF32231.1）70%的相似性。通过原核表达AaBDH后,经提取与分离纯化,获得了比较纯的AaBDH蛋白,为验证其功能,以2-茨醇为底物进行了体外实验。结果表明,无论在辅酶NAD+或NADP+存在下,AaBDH均能转化2-茨醇为樟脑,但在NAD+存在的条件下AaBDH的酶活性较在NADP+存在的条件下要强。而对照组中（无AaBDH）,无论在辅酶NAD+或NADP+存在下,均未检测到樟脑。可见,该酶能氧化2-茨醇,从而验证了AaBDH属于2-茨醇脱氢酶。6、采用气相色谱仪器与氢火焰检测器建立了一种灵敏度高、成本低、操作方便的二氢青蒿酸检测法。该方法的回收率达98%以上,检测限小于3μg/mL,定量限小于9 μg/mL,样品需求量为0.1 g左右,分析时间为20 min,适用于黄花蒿原料、黄花蒿提取物以及纯化产品中二氢青蒿酸的含量与纯度分析。该方法的建立为二氢青蒿酸产品开发、二氢青蒿酸的生物合成研究及黄花蒿优异资源考察提供了可靠的分析手段。7、建立了青蒿素生产的副产物二氢青蒿酸的提取纯化工艺。考察了碱提浓度、超声提取时间、超声波功率以及酸沉pH值单因素对青蒿素生产废料中二氢青蒿酸提取效果的影响,确定了初步提取工艺。在此基础上,采用响应面分析法对提取工艺进行了优化,确定了二氢青蒿酸碱提酸沉最佳生产工艺。结果表明最佳工艺条件为：NaOH浓度为0.3%,提取时间为48.7 min,pH值为1.（?）,功率为75.2 w,料液比为1：7。采用离子交换树脂法,以二氢青蒿酸的吸附量和解吸率为指标,确定青蒿素生产副产物中二氢青蒿酸的最佳纯化工艺参数,筛选分离纯化最佳阴离子交换树脂、洗脱剂类型、洗脱剂浓度,上样量及洗脱液体积。结果表明,717阴离子交换树脂对青蒿素生产副产物中二氢青蒿酸的交换能力最强。最佳工艺条件为洗脱剂10%氯化铵+80%乙醇,100 mg/mL浓度下上样液体积为3 BV,洗脱体积为3 BV。该工艺有望有效解决青蒿素生产废液的污染问题,变废为宝,对降低青蒿素生产成本有重要意义。