EMS诱变大豆突变体的鉴定与大豆开花调控基因GmSVP1和GmOFP1的克隆及功能分析

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qianchuanzhishui
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大豆[Glycine max (L.)Merri.]是我国重要的经济作物和粮油作物,是人类蛋白质、油脂等营养物质的主要来源,在食品工业和农业生产中占有重要地位。受多种因素限制,我国大豆产量和种植面积逐年减少,导致我国从大豆的主要原产国和出口国转变为最大的进口国。植物突变体是进行功能基因组学研究的重要材料,由于大豆遗传转化效率低等因素限制,目前还没有获得较大规模的大豆转化突变体。因此,理化诱变就成为产生大豆突变材料的有效途径之一,突变体的研究也成为了目前大豆功能基因组研究的重要内容,突变体可为大豆功能基因组的深入研究提供材料基础。本研究以栽培大豆“南农86-4"作为研究对象,利用化学诱变剂—甲基磺酸乙酯(ethylmethane sulfonate, EMS)对其进行处理,通过多代表型筛选和分子标记鉴定获得表型变异性状稳定遗传的大豆突变体,并对筛选获得的大豆早花突变体elf1进行了CGH芯片研究,对两个大豆开花调控相关基因进行分子克隆和功能分析,对大豆黄绿变异株cdl进行了遗传定位研究。获得如下结果:1.利用化学诱变剂EMS诱变栽培大豆“南农86-4",通过多代田间表型筛选及SSR分子标记鉴定,共获得34个表型变异稳定遗传的株系(M6代),变异表型主要包括茎发育、叶片发育、开花期、种子等性状,通过变异表型描述,加深对获得突变体变异类型的了解。这些表型变异材料将为大豆功能基因组研究提供重要的基础材料。2.在诱变后代M3代中筛选获得1株开花期提前大豆变异株(L96,早约20天),经多代筛选获得早花性状稳定遗传株系,命名为elfl (early flowering 1) 。将突变体elf1与对照杂交,杂交后代所有F1单株的开花时间与对照亲本开花时间相同,并且在获得的F2群体中,正常开花与早开花性状发生分离,卡方测验表明,正常开花与早开花单株数量符合3:1比例,表明突变体elf1的早花性状受隐性单基因控制。利用比较基因组杂交(CGH)技术在对照与突变体elf1间未检测到基因组水平的碱基差异。3.在大豆中克隆了GmSVPl基因,生物信息学分析结果表明该基因都含有8个内含子,9个外显子,编码蛋白都具有两个保守的MADS-box结构域,即MADSMEF2like与K-box结构域;研究表明,GmSVP1 与 GmSVP2基因与豌豆中的PsSVP亲缘关系最近,并且主要在大豆花器官-雌蕊和雄蕊中表达;亚细胞定位结果表明GmSVP1基因主要在细胞膜中表达;非生物胁迫诱导实验表明,基因GmSVPl对于温度胁迫(高温(45℃)和低温(4℃))较为敏感,而对于盐胁迫(150mM)和机械损伤胁迫表现不敏感。利用农杆菌浸染叶盘法将GmSVP1基因转化烟草,对获得的T0和T1代的阳性烟草转化植株进行表型和分子鉴定发现,转基因阳性烟草植株的开花期发生了不同程度的提前,花瓣开裂、雄蕊数目和发育变异等,这些结果可能与基因GmSVP1的过量表达有关,初步表明该基因可能主要参与调节大豆开花期和花瓣和雄蕊的形态建成。4.在大豆中克隆了GmOFP1基因,生物信息学分析表明基因GmOFPl和GmOFP2都不含内含子,GmOFP2编码的蛋白质较GmOFPl少70个氨基酸,它们与拟南芥基因AtOFP17亲缘关系较近;基因GmOFPl主要在大豆花器官-花瓣、雄蕊和雌蕊中表达;非生物胁迫诱导研究表明,大豆GmOFP1基因在受到高温胁迫(45℃)和N aCl (150mM)胁迫诱导后都会做出应答响应,而GmOFP2基因则对于温度、盐和机械损伤等非生物胁迫无显著应答响应。通过农杆菌介导的叶盘转化法将大豆GmOFP1基因转入烟草,共获得6株T0代转GmOFPl阳性烟草植株,表型鉴定发现这6株阳性烟草植株的花瓣主要发生了花瓣开裂变异和花瓣向内折叠变异等,初步表明大豆GmOFP1基因可能具有控制花瓣的发育的功能。5.在诱变M3代筛选获得黄绿变异株(L31),经多代筛选鉴定后黄绿表型稳定遗传,命名为‘’cd1" (chlorophyll-deficent 1)。研究表明,cd1在株高、百粒重、单株粒重等显著低于对照;cd1的叶绿素含量比对照降低约30-66%,并且其叶绿体形状表现畸形,其内部的基粒类囊体片层较对照显著减少;遗传分析表明,cd1的黄绿表型受隐性细胞核单基因控制,利用F2分离群体将叶色控制基因CD1定位于O连锁群(Chr.10),并与标记Satt633和Sat291连锁,连锁距离分别为2.48cM和4.48cM。
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