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目的:建立成年猫背根节体外培养技术,探讨部分背根切除和针刺对备用背根节(DRG)生长的影响及内源性c-fos、c-jun和GDNF、NT-4对备用DRG的作用。 方法:成年健康雄猫10只。随机分2组,每组5只:正常对照组、针刺备用根模型组(行双侧部分去背根手术,切除双侧L1-L5,L7-S2 DRG,保留L6为备用根,针刺一侧备用DRG外周支配区内的两组穴位:足三里和悬钟,伏兔和三阴交。针刺频率98次/分,时间为30分钟,每15分钟时交换电极,每天针刺1次,每次针刺一组穴位,两组穴位交替进行,动物术后存活7天)。两组动物在无菌条件下取出双侧L6 DRG,分别经0.25%胶原酶(pH 7.4由DMEM配制)消化3小时,经离心漂洗,最后加入神经元培养液制成5-10×105的单细胞悬液,接种于包被有多聚赖氨酸和层粘连蛋白的48孔板中,入37℃ 5%CO2恒温培养箱中进行体外培养。24h全量换液,同在针刺侧L6 DRG的一部分培养孔内分别加含抗c-Fos、c-Jun和GDNF、NT-4抗体1∶100培养液,作为抗体封闭组。分别于1、3、5、7天250倍下每组随机测量30个视野的细胞突起长度。用抗NSE抗体行免疫细胞化学ABC法染色进行鉴定。将所得的数据用spss统计软件包进行多个样本均数间比较的方差分析、q检验。 结果:1d:正常组,只有少数细胞有生长锥或者有突起生长,突起平均长度为26.58±10.05μm;备用根组,有一半左右的细胞有生长锥的出现或突起生长,突起平均长度为53.84±13.97μm;针刺组,大部分细胞有生长锥的出现或有突起生长,突起的平均长度为72.92±16.35μm。各组神经突起长度经统计学分析P<0.05。但由于标准差太大,故实际意义不大。 3d:正常组,有突起生长的细胞增多,突起平均长度约为56.66±16.52μm,部分细胞的突起开始相互连接;备用根组,大部分细胞有突起生长,突起平均长度约为106.64±17.02μm,大多数细胞突起开始连接成网状,神经网络开始形成;针刺组,硕士研究生学位论文针刺对备用DRG生长的影响及内源性c-fos、c-jun和GDNF、NT-4的作用初探其突起平均长度约133.56士15.67林m,可见多数细胞的突起相互连接成网状,神经网络初步形成。以上三组突起长度经统计学分析P<0.05。对于24h后加有各抗体的(抗c一Fos、c一Jun、GDNF、NT-4抗体)各组细胞而言,与相应针刺组相比较无明显差异。 5d:正常组,突起平均长度约为85.86士18.40林m,大部分细胞的突起相互连接,神经网络初步形成;备用根组,突起平均长度约为138.56士12.27林m,神经网络形成;针刺组,其突起长度约为胞体195.22士14.29林m,形成完整的神经网络。以上三组突起长度经统计学分析P<0.05。对于加有抗体的各组,与针刺组相比较p>.05,尽管此时无统计学意义,但各抗体组细胞突起的平均长度开始小于针刺组。 7d,正常组,突起平均长度为106.64士14.99拼m,形成较为完整的神经网络;备用根组,突起平均长度约为155.36士15.16林m,形成完整的神经网络:针刺组,其突起长度约为205.44士19.76林m,神经网络密集而清晰。以上突起长度三组经统计学分析P<0.05。对于加有抗体的各组细胞突起长度分别如下:抗c一Fos抗体组1 85.68土15.50林m、抗e一Jun抗体组178.54士16.15林m、抗GDNF抗体组155.68士15.06协m、抗NT-4抗体组1 91.14士17,38林m,各组l’edp>0.05。针刺组与抗NT-4抗体组ltijp>0.05,而针刺组与其余三抗体组间p<0.05。 培养的DRG细胞经抗NSE抗体行免疫细胞化学ABC法。可见95%以上NSE阳性反应的细胞为典型的体外培养的DRG神经元;另有极少数NSE阳性的类成纤维型细胞。 结论:我们建立了一种体外培养成年猫DRG神经元的可靠方法。部分去背根术后,各时间段备用DRG神经元的突起比正常DRG长(P<0.05),提示部分背根切断致DRG生长活性增加。针刺备用根后,DRG神经元突起比备用DRG组长(P<0.05),提示针刺促进DRG神经元的生长,进而促进脊髓可塑性。从各抗体组的生长状况与针刺组比较发现:cjun、c一fos、GDNF可能分别在DRG和脊髓可塑性中发挥了一定的作用。而NT-4在DRG生长中发挥的作用却不明显。