胃癌已经成为危害人类健康的重大公共卫生问题。在全球范围内,胃癌的发病率位于第五位而死亡率位于第三位,是人类常见的消化道恶性肿瘤之一。而转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因,据统计显示大约90%的恶性肿瘤患者的死亡是由于转移所导致。但是目前的临床治疗方法都无法完全阻止胃癌复发和转移。肿瘤转移是恶性肿瘤进程中的重要特征,是多步骤的复杂过程。但是目前在肿瘤生物学中肿瘤转移过程的本质仍了解不多,导致临床上缺乏能够有效抑制肿瘤转移的治疗方法。目前已经有很多研究表明蛋白翻译后修饰与肿瘤的转移相关,这意味着蛋白翻译后修饰相关分子可能成为抗肿瘤转移的靶点以及肿瘤患者预后与生存的生物标志物。在哺乳动物细胞中,蛋白的降解主要是依赖于泛素-蛋白酶体途径。泛素-蛋白酶体途径是一个三酶级联,包括E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶。E3泛素连接酶可以特异性的靶向降解蛋白,但是如果E3泛素连接酶功能丧失以及不正确的靶向降解,则会导致许多疾病的发生。目前已经有许多研究发现泛素化与包括胃癌在内的恶性肿瘤转移相关。有研究发现MDM2和TRAF6等许多E3泛素连接酶在癌症中发挥癌基因的作用。但是目前它们相应的抑制剂Nutlin-3与EGCG已经应用于临床前研究。因此,靶向泛素-蛋白酶体途径可以作为抗肿瘤治疗的新策略。JWA基因,又名ARL6IP5,前期本课题组发现JWA参与细胞应答,保护正常细胞免受DNA损伤。JWA通过SP1阻断MMP2信号通路从而抑制胃癌血管生成。在HER2阳性的胃癌细胞中,JWA通过MAPK信号通路来抑制细胞迁移。除此之外,在许多肿瘤中JWA表达比癌旁组织低,例如黑色素瘤,肝癌和胃癌,同时还发现肿瘤组织中JWA表达较低的患者生存状况较差。这些研究均表明JWA在胃癌中发挥抑癌基因的作用我们预测发现RNF185可能会泛素化降解JWA,并且也在后续的实验中得到验证,为了探讨RNF185通过JWA调控胃癌转移的作用机制,通过构建胃癌细胞的体外模型以及小鼠体内转移模型,结果显示RNF185通过泛素化降解JWA促进胃癌转移。目的:探讨RNF185通过JWA调控胃癌转移的作用机制以及寻找JWA泛素化位点方法:(1)免疫印迹实验检测RNF185与JWA在胃癌细胞以及组织中的表达。(2)免疫共沉淀以及免疫荧光实验检测RNF185与JWA的相互作用以及细胞中的定位。(3)RNF185高表达质粒以及RNF185 si RNA在胃癌细胞在进行转染,免疫印迹实验检测JWA的表达情况,免疫共沉淀实验检测JWA的泛素化情况,穿孔与划痕实验检测细胞的迁移情况。(4)通过回复实验,在胃癌细胞中转染HA-RNF185以及Flag-JWA,穿孔与划痕实验检测细胞的迁移情况。(5)构建JWA突变质粒,Flag-JWA(K31R),Flag-JWA(K151R),Flag-JWA(K158R),FlagJWA(K185R),Flag-JWA(ALL)。通过免疫印迹,免疫共沉淀和穿孔实验寻找JWA的泛素化位点。(6)构建RNF185稳定高表达的BGC823细胞株,小鼠尾静脉注射,通过免疫组化实验检测小鼠胃癌细胞肺转移情况以及RNF185与JWA表达情况。结果1.JWA可能通过泛素-蛋白酶体途径降解。在胃癌细胞BGC823和SGC7901中,加入CHX处理,观察到内源性JWA蛋白水平随时间而降低。此外,当用MG132处理细胞时,JWA的蛋白增加。在BGC823和SGC7901细胞中转染Flag-JWA,结果显示外源性JWA蛋白在CHX处理后,随时间也会发生减少,并且在MG132处理后,外源性的JWA蛋白也会增多。2.JWA与RNF185存在相互作用。通过网站预测发现一个E3泛素连接酶RNF185可能与JWA相互作用。免疫共沉淀实验验证在BGC823和HGC27细胞中RNF185和JWA之间存在相互作用。免疫荧光实验显示在BGC823细胞中RNF185和JWA共定位于细胞质中。3.RNF185在蛋白水平负调控JWA。在BGC823或SGC7901细胞中转染HARNF185,免疫印迹实验显示JWA蛋白表达降低至对照细胞的43%与38%。在HGC27细胞转染RNF185 si RNA,结果显示JWA蛋白表达增加至对照组的2.91-4.91倍。通过免疫印迹实验检测了9个胃癌与胃粘膜上皮细胞系(R=-0.67,p<0.05)和22个胃癌原发性肿瘤组织(R=-0.42,p<0.05)中JWA与RNF185蛋白水平,两个结果皆显示RNF185与JWA呈负相关。进一步构建了Kaplan-Meier生存曲线,结果显示具有RNF185高表达的患者预后差(N=99,log-rank检验,P<0.01)。将RNF185和JWA合并为一个新变量时,并将患者分为3组:高RNF185和低JWA组;低RNF185和高JWA;其他。结果显示,RNF185高和JWA低的患者预后较差(N=99,log-rank检验,P<0.01)。4.RNF185促进JWA泛素化降解。胃癌细胞BGC823与SGC7901转染HARNF185后,再用CHX处理,结果表明RNF185高表达会促进JWA的蛋白稳定性降低,进一步利用BGC823/DDP细胞和HGC27细胞,发现转染RNF185 siRNA后,再加入CHX处理,JWA的蛋白稳定性增加。免疫共沉淀实验结果显示在胃癌细胞中JWA会发生泛素化,并且RNF185高表达进一步增强了0.46倍的JWA泛素化,而RNF185敲低明显减弱了34%的JWA泛素化。免疫荧光实验结果显示JWA在内质网与线粒体上都存在共定位,但是高表达RNF185后JWA与内质网的共定位减少,但是与线粒体的共定位未有明显改变,表明RNF185主要降解内质网上的JWA蛋白。5.RNF185通过下调JWA表达促进胃癌细胞迁移。穿孔实验结果显示BGC823和SGC7901细胞高表达RNF185后细胞迁移分别增加至相应对照细胞的2.07倍与2.08倍,划痕实验表明在高表达RNF185后细胞迁移增加至1.63与1.74倍。穿孔实验证明HGC27和MGC803细胞敲减RNF185后细胞迁移分别降低至对照细胞的64%-79%与53%-57%。划痕实验也证明RNF185敲减后细胞迁移减少至60%-63%与68%-69%。进一步使用回复实验,在BGC823细胞中将HA-RNF185和Flag-JWA质粒共转染,穿孔和划痕实验显示高表达JWA可以逆转由于RNF185高表达所导致的胃癌细胞迁移增加。6.JWA的K158位点是其在胃癌细胞中泛素化所必需的。将Flag-JWA(WT),四个单泛素化位点突变体(Flag-JWA(K31R),Flag-JWA(K151R),Flag-JWA(K158R),Flag-JWA(K185R))和一个多泛素化位点突变体Flag-JWA(ALL)分别转染到HGC27细胞中,加入CHX处理,免疫印迹实验结果显示在胃癌细胞中Flag-JWA(K158R)和Flag-JWA(ALL)突变体没有发生降解。将Flag-JWA(WT)和Flag-JWA(K158R)突变体转染到BGC823和SGC7901细胞中,再用CHX处理,结果显示Flag-JWA(K158R)突变体比Flag-JWA(WT)更稳定。通过免疫共沉淀实验检测Flag-JWA的泛素化,发现Flag-JWA(K158R)突变体泛素化水平是Flag-JWA(WT)的35%。穿孔实验表明,转染Flag-JWA(K158R)突变体比转染Flag-JWA(WT)的HGC27细胞迁移减少40%。在BGC823和SGC7901细胞中高表达RNF185可以增加Flag-JWA(WT)的降解,但是不能增加Flag-JWA(K158R)突变体降解。穿孔实验表明,Flag-JWA(K158R)突变体也可以逆转由RNF185高表达所诱导的细胞迁移增加。7.在体内RNF185通过下调JWA表达而促进胃癌转移。利用慢病毒构建稳定高表达RNF185的BGC823细胞(LV-RNF185)和相应的对照细胞(LV-NC),通过尾静脉将胃癌细胞注射小鼠体内。40天后,处死小鼠并且检查肺脏中肿瘤形成情况,结果显示LV-RNF185组比LV-NC组有更多和更大的肿瘤转移灶形成。肺组织切片的HE染色检查也显示LV-RNF185组小鼠中转移灶面积增加至LV-NC组的3.20倍。免疫组化实验显示LV-RNF185组中的JWA表达远低于LVNC组。结论:本研究首次证实RNF185可以通过泛素-蛋白酶体途径降解JWA促进胃癌转移,此外我们也发现JWA的泛素化位点是K158位点。本研究成果提示RNF185可以作为治疗胃癌转移的潜在新靶标。