呼吸道上皮细胞是许多呼吸道病原感染的靶细胞,而对于猪呼吸道病原的研究一直以来都缺乏良好的体外模型,应用ALI培养气管上皮细胞可以获得分化的纤毛细胞、紧密连接和具有黏液分泌功能的体外细胞模型,因此备受科研工作者的偏爱。本研究的目的通过对培养条件的筛选和优化建立可在体外分化的原代PTEC模型培养方法并使之标准化。从猪健康状态、日龄和品种筛选供体猪,采取气管组织,低温条件下用链酶蛋白酶分离气管上皮细胞。对收集PTEC贴壁能力和建立ALI的时间观察,最终选择呼吸道疾病病原Mhp、PRRSV、PCV-2、SIV、CSFV、PRV-gE、Mhr检测结果均为阴性的二元猪。分别从原代PTEC细胞来源、蛋白酶分离时间、细胞接种密度、生长培养基的成分、培养体系对PTEC贴壁率、增殖和分化的的影响,筛选出适合建立猪气管上皮细胞ALI分化培养模型的条件。通过间接免疫荧光法、上皮细胞电生理特征和扫描电子显微镜评价建立PTEC体外分化模型可靠性。将细胞密度为2.67-3.917×106cells/cm2的PTEC接种在人胎盘胶原蛋白IV包被的0.4μm多孔支持膜上,细胞贴壁率高可建立ALI。当建立ALI时细胞为多边形,呈鹅卵石状铺满膜底部;培养基中添加EGF和FBS可促进细胞贴壁,但它们对细胞增殖有影响,从而影响建立ALI的时间。本实验筛选出的生长培养基是在BEGM中额外添加15ng/mLEGF,分化培养基是在BEGM中额外添加15ng/mLRA和2%USG。最后通过TEER和SEM进行观察,发现有纤毛细胞和紧密连接形成,TEER值最高为1838±226fΩcm2。用优化的培养条件培养复苏的冻存PTEC,同样也有紧密连接和纤毛细胞生成。本研究成功建立猪气管上皮细胞ALI体外分化培养模型并使之标准化。