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背景:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种典型的中枢神经系统(central nervous system,CNS)自身免疫性疾病,其主要病理特征包括炎性细胞浸润、髓鞘丢失伴神经轴索损伤。目前MS的病因和发病机制尚不明确,但研究发现患者体内T淋巴细胞异常活化。因此,现阶段认为T淋巴细胞在MS的发病过程中起到了重要的作用。抗淋巴/胸腺细胞球蛋白是一种生物性免疫调节类药物,是以人的淋巴细胞或胸腺为抗原,免疫健康的马、兔、猪等动物后,分离纯化其抗血清所得到的靶向T淋巴细胞的免疫球蛋白。目前,MS的造血干细胞移植疗法临床II期试验中,已有抗淋巴/胸腺细胞球蛋白联合环孢素(CsA)作为移植前预处理的相关药物的报道,但尚无抗淋巴/胸腺细胞球蛋白类药物直接应用于MS及其动物模型的相关研究。我国从上世纪70年代初开始研制该类药品,在充分对比了各种类型的免疫抗原和被免疫动物后,于1976年成功研制出抗人T细胞猪免疫球蛋白(Anti-human T Lymphocyte Porcine Immunoglobulin,ALG)。与国外同类型产品相比,ALG具有效价高,药物副作用小,造价低廉等优点。本课题将研究ALG在MS的动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠中的治疗作用,并进一步探讨其靶向抑制T淋巴细胞的分子机制,为抗淋巴/胸腺细胞球蛋白类药物在MS的治疗中的应用提供理论与实验依据。目的:研究ALG对EAE模型大鼠的治疗作用,并揭示ALG通过靶向抑制T淋巴细胞减轻CNS炎性损伤的潜在机制。方法:1.ALG对EAE模型大鼠治疗作用的评价:将6-8周龄Sprague-Dawley大鼠(雌性)随机分为Control组、EAE+IgG组(猪IgG对照组)和EAE+ALG组(治疗组)。通过大鼠脑脊髓组织匀浆抗原两次免疫的方法诱导建立大鼠EAE模型。第一次免疫后第15天(发病率达到30%)开始,按照20mg/kg的剂量每日尾静脉给予ALG(EAE+ALG组)或同体积IgG(EAE+IgG组),持续7天(至第一次免疫后第21天);同时观察各组大鼠行为学表现进行评分并记录。第一次免疫后第22天处死大鼠收集脊髓组织、外周血和脑脊液。分别通过苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)和坚牢蓝(Luxol fast blue,LFB)染色来对各组大鼠脊髓白质区域的炎性细胞浸润及髓鞘丢失情况进行评价;通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组大鼠外周血和脑脊液(Cerebrospinal fluid,CSF)中促炎细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-17的表达。2.ALG靶向T淋巴细胞的免疫调节作用的评价:采集健康志愿者及正常大鼠外周血分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。将细胞随机分为ALG处理组和IgG处理组,在细胞水平通过APC标记的抗人CD3和FITC标记的抗猪IgG抗体,检测ALG在PBMC中的靶向性;将收集的PBMC细胞随机分为Control组、PMA+Ionomycin组、PMA+Ionomycin+IgG组以及PMA+Ionomycin+不同浓度的ALG组,通过ELISA检测各组PBMC中促炎细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-17的表达情况。3.ALG调节T淋巴细胞活化、增殖、凋亡和分化作用的研究:将收集到的PBMC随机分为Control组、PMA+Ionomycin组、PMA+Ionomycin+IgG组和PMA+Ionomycin+ALG组。通过ELISA和流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测ALG对T淋巴细胞活化后细胞表面CD69、CD25及IL-2表达的影响;通过FCM检测ALG对活化后T淋巴细胞向CD4、IFN-γ双阳性的Th1亚群辅助性T细胞和CD4、IL-17双阳性的Th17亚群辅助性T细胞分化的影响;通过CFDA-SE(Carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CSFE)试验、Annexin-V/PI双染和CCK-8法检测ALG对T淋巴细胞增殖和凋亡的影响。4.ALG生物安全性的评价:采用不同浓度的ALG处理原代大鼠神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞48h后,通过CCK-8法检测上述细胞活性;通过HE染色观察Control组、EAE+IgG组和EAE+ALG组大鼠心、肝、脾、肺、肾的病理学改变。结果:1.ALG缓解EAE模型大鼠炎性脱髓鞘所引起的神经功能损伤:Control组大鼠在实验过程中无发病症状;EAE+IgG组大鼠有明显神经功能损伤表现,且症状呈进行性加重;给予ALG治疗能够改善EAE大鼠神经功能损伤表现,降低其行为学评分。HE和LFB染色结果显示:EAE+IgG组大鼠脊髓白质区域存在散在髓鞘丢失斑块及炎性细胞浸润,给予ALG治疗可以减轻EAE模型大鼠脊髓炎性细胞浸润和脱髓鞘程度。ELISA结果显示:EAE+IgG组大鼠的外周血和CSF中促炎细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-17表达增高,而在EAE+ALG组中上述促炎细胞因子的表达显著降低。2.ALG抑制T淋巴细胞促炎细胞因子的表达:细胞免疫荧光双标结果显示,ALG与人/大鼠PBMC中CD3~+的细胞存在共定位现象;ELISA结果显示,ALG预处理能够呈剂量依赖性地降低活化的PBMC中促炎细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-17的分泌。3.ALG抑制T淋巴细胞向Th1/Th17亚群的分化:FCM证实ALG预处理对活化后T淋巴细胞表面CD69和CD25的表达无影响,但抑制了活化T细胞IL-2的分泌。CSFE、Annexin-V/PI双染及CCK-8结果表明ALG对活化后T淋巴细胞的增殖和凋亡无影响;FCM结果证实,ALG预处理能够降低活化的T淋巴细胞中IFN-γ、CD4双阳性及IL-17、CD4双阳性细胞所占比例,即ALG预处理能够降低活化后T淋巴细胞中Th1/Th17亚群辅助性T淋巴细胞比例。4.ALG对大鼠无毒副作用:CCK-8结果显示,不同浓度ALG对原代大鼠神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞活性无影响。各组大鼠心、肝、脾、肺、肾组织HE染色无异常病理改变。以上结果证明:ALG对大鼠神经元、胶质细胞及组织器官无明显毒性作用。结论:本研究发现,ALG能有效抑制EAE模型大鼠CNS的炎性反应,缓解模型大鼠炎性脱髓鞘所引起的神经功能损伤症状;进一步研究证实:ALG的免疫调节功能可能是通过靶向T淋巴细胞,抑制T淋巴细胞向促炎性Th1和Th17亚群细胞分化,从而减轻自身反应性T淋巴细胞活化所介导的CNS炎性损伤。以上研究为抗淋巴/胸腺细胞球蛋白类药物应用于MS的治疗提供了理论及实验依据。